[發(fā)明專利]一種家禽支原體PCR檢測引物及應用該引物的試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010720267.3
• 申請日: 2020-07-23
• 公開（公告）號: CN111893199B
• 公開（公告）日: 2022-12-02
• 發(fā)明（設計）人: 徐懷英;秦卓明;黃迪海;楊金興;亓麗紅;劉星麗
• 申請（專利權）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所（山東省無特定病原雞研究中心）
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 趙斌

本發(fā)明涉及生物技術領域，涉及一種家禽支原體PCR檢測引物及應用該引物的試劑盒，該試劑盒中包括引物F和引物R。引物F的序列如SEQ ID NO.1所示，引物R的序列如SEQ ID NO.2所示，該試劑盒具有特異性強、靈敏度高、快速簡便等優(yōu)點，適合于基層單位和科研院所應用推廣，為MGC在禽類中的監(jiān)測及其防控提供技術支撐。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，涉及一種家禽支原體PCR檢測引物及應用該引物的試劑盒。

背景技術

禽類支原體在全球范圍內(nèi)流行，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來極大的危害。目前常見的家禽致病性支原體主要有雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum，MG)、滑液囊支原體(Mycoplasma synoviae，MS)、火雞支原體(Mycoplasma meleagridis，MM)和衣阿華支原體(Mycoplasma iowae，MI)，MS和MG對雞致病，MM和MI對火雞致病。家禽支原體(Mycoplasmagallinaceum，MGC)最早發(fā)現(xiàn)于20世級80年代的支原體流行病學調(diào)查，陸續(xù)從英國、日本及南非等地的雞、鴨、火雞和鳥類的呼吸道和生殖道中分離到該菌，最初被認為是無致病性支原體，最近幾年的國外研究表明，其在雞群中陽性率為25％，與傳染性支氣管炎病毒在雞氣管內(nèi)共感染時，可增加病毒在氣管粘膜的病毒含量，我國未見有MGC的相關研究報道。

診斷支原體的標準方法是病原體的分離和鑒定，但由于支原體生長營養(yǎng)需求較高，培養(yǎng)基中需要加入血清，且支原體生長相當緩慢，通常需要培養(yǎng)3-10天才能形成菌落，不利于疾病的診斷。聚合酶鏈式反應(PCR)具有簡單快捷、特異性好、敏感性高的有點，是目前應用最廣的分子診斷方法，需要的儀器為普通的PCR儀在基層實驗室較為常見，因此獲得MGC的PCR專用試劑盒并建立MGC的PCR診斷方法在臨床上具有較高的應用價值。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述情況，本發(fā)明的發(fā)明人首先提供了一種家禽支原體PCR檢測引物及應用該引物的試劑盒，該試劑盒中包括引物F和引物R。引物F的序列如SEQ ID NO.1所示，引物R的序列如SEQ ID NO.2所示，該試劑盒具有特異性強、靈敏度高、快速簡便等優(yōu)點，適合于基層單位和科研院所應用推廣，為MGC在禽類中的監(jiān)測及其防控提供技術支撐。

發(fā)明人首先提供了一對特異性引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID No.1和2所示，該引物分別為引物F和引物R，可用于PCR檢測家禽支原體，其具體序列為：

上游引物為F：5`-GGGATAACGCTGAGAAAT-3`，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

下游引物為R：5`-GTTAGCTGCGCCGATGAG-3`，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

上述引物是針對針對MGC16SrRNA設計獲得的特異性引物，利用該引物擴增待測樣品的DNA，當樣品中擴增出724bp條帶(其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；)時，說明該樣品中含有家禽支原體，其具體步驟如下：

(1)提取待測樣品的DNA；

(2)建立PCR反應體系，并利用上述引物進行PCR反應；

(3)將PCR反應產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，當樣品中擴增出724bp條帶時，說明該樣品中含有家禽支原體。

其中，步驟(2)中PCR反應體系為：10×PCR Mix 2.5μL、dNTP Mixture2.0μL、20mmol/L的引物F和引物M各0.5μL、Taq DNA Polymerase0.25μL，待檢樣品DNA模板2μL，然后用RNA-free dH₂O補足終體積至25μL；

步驟(2)中PCR反應條件為：95℃5min；進入94℃30s，52℃45s，72℃50s，共進行35個循環(huán)；72℃10min，4℃結(jié)束反應。