[發明專利]一種用于宮頸癌檢測的試劑盒、使用方法

在審

• 申請號: 202010719497.8
• 申請日: 2020-07-23
• 公開（公告）號: CN111808962A
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 王志強;萬季;潘曉新;夏迪;金泰慶;蔡雪兒;羅海燕;王一杏;關建洪;王弈;宋麒
• 申請（專利權）人: 深圳市新合生物醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京冠和權律師事務所 11399
• 代理人: 朱健

本發明公開了一種用于宮頸癌檢測的試劑盒、使用方法、應用。該試劑盒通過檢測或測量受試樣品DNA中一種或多種特定基因的甲基化狀態或水平來篩查和診斷宮頸癌。經實驗測試，本發明的方法具有快速、靈敏度高和特異性高等特點，能夠在早期及時對人宮頸癌進行診斷，使得早期準確診斷宮頸癌成為可能，避免了醫療資源的浪費。本發明試劑盒能夠顯著提高早期宮頸癌的陽性檢出率和特異性(真實陰性率)。

技術領域

本發明屬于生物技術和DNA檢測技術領域，尤其涉及一種用于宮頸癌檢測的試劑盒、使用方法、應用，具體而言，涉及一種利用宮頸細胞DNA進行甲基化qPCR以確定一個目標基因靶點的甲基化狀態來用于宮頸癌檢測或篩查的試劑盒及其使用方法，此外，本發明還涉及上述檢測試劑盒在生物醫學中的應用。

背景技術

宮頸癌是女性最常見的癌癥之一，多發生于宮頸鱗柱交界處(移行帶)。在全球范圍內，估計2018年有57萬例新發病例，占所有癌癥死亡婦女的7.5％。而中國的宮頸癌病例占全球的28％以上，高發年齡為50—55歲。近年來，中國宮頸癌的發病率和死亡率一直呈上升趨勢。其中85－90％為鱗狀細胞癌，余下的10－15％中多數為腺癌。宮頸癌的臨床表現多不明顯，或僅有類似宮頸炎的癥狀，容易造成漏診；一旦出現癥狀，多已發展到晚期，從而喪失了最佳的治療窗口。

多項大型研究表明，定期接受宮頸癌篩查是預防宮頸癌的最佳方法。常用的宮頸癌篩檢方式主要有兩種，一種是常見的宮頸細胞學檢查，包括傳統的巴氏涂片(Pap test)和液基薄層細胞技術(TCT)兩種方式，通過觀察子宮頸部的分泌物而篩查可能發生癌變的非典型細胞，以早期偵測宮頸癌；另一種則為人類乳突病毒檢測(HPV testing)，即觀察宮頸脫落細胞中是否存在高危HPV亞型的感染。然而巴氏涂片法因取材、制片、閱片過程中存在的問題以及傳統的巴氏五級分類法等都是導致它敏感性低的原因，故臨床上假陰性者多見；液基薄層細胞技術因相關設備及檢查耗材價格昂貴，導致它難以普及；人類乳突病毒檢測雖然具有高敏感度，卻容易造成高的假陽性，會導致臨床上的過度治療和增加病人的負擔。因此，臨床上急需能夠即時、準確，并且費用低的宮頸癌早期檢測技術的出現。

DNA甲基化改變是癌癥進程中最早發生的分子變化之一，且具有組織特異性，腫瘤抑制基因的高甲基化水平已被確定為抑制基因表達和促進癌細胞生長和擴增的重要機制。在宮頸癌中，一些抑癌基因的CpG(胞嘧啶(C)后接續鳥苷(G))的高甲基化已被認為是癌癥的生物標記之一。因此，對這些基因中的一種或多種的甲基化狀態進行分析可用于診斷宮頸癌的狀態。在宮頸癌篩查中，由于能直接收集到宮頸的上皮細胞，因此通過分析宮頸細胞中的基因甲基化來早期診斷、檢測或者篩查宮頸癌，比發生在其他器官上的腫瘤更容易操作。

發明內容

在上述資料的基礎上，我們通過更加廣泛和深入的研究，發現了可用于早期宮頸癌篩查的更好的甲基化基因靶點，并設計出數套可針對這些靶點進行甲基化檢測的引物及探針組合，我們的方案可取得更高的檢測特異性和敏感度，利用新發現的基因靶標檢測組合制成了早期宮頸癌癌的檢測和篩查試劑盒。

本發明的目的在于提供一種用于宮頸癌早期診斷、檢測或者篩查的多基因聯合檢測引物探針組合試劑盒，以解決現有技術中存在的檢測方法特異性和敏感性過低的缺陷。

本發明的第一方面在于提供一種用于宮頸癌檢測的試劑盒，通過檢測或測量受試樣品DNA中一種或多種特定基因的甲基化狀態或水平來篩查和診斷宮頸癌。

在一些實施方式中，所述試劑盒包括檢測或測量受試樣品DNA中一種或多種特定基因的甲基化狀態或水平的特異性引物和探針，所述特定基因包括PAX1和ACTB。

在一些實施方式中，用于檢測PAX1基因甲基化狀態的特異性引物和探針選自下述三種特異性引物和探針組合中的任一種：特異性引物SEQ ID NO:1-2和探針SEQ ID NO:3、特異性引物SEQ ID NO:4-5和探針SEQ ID NO:6、特異性引物SEQ ID NO:7-8和探針SEQ IDNO:9。