[發明專利]一種酶法生產丹參素的方法

在審

• 申請號: 202010719293.4
• 申請日: 2020-07-23
• 公開（公告）號: CN111662936A
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發明（設計）人: 李超;張振東;王戩
• 申請（專利權）人: 上海市第一婦嬰保健院
• 主分類號: C12P7/42
• 分類號: C12P7/42;C12N15/70;C12N9/02;C12N9/04
• 代理公司: 上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙) 31262
• 代理人: 周春洪

1.一種酶法生產丹參素的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：設計并優化D-扁桃酸脫氫酶(ManDH；GenBank：WP_05693439)、苯丙氨酸-4-羥化酶(PAH；GenBank：WP_012854034)和4-羥苯乙酸3-羥化酶(HpaH；GenBank：TPY_2462、TPY_2460)的基因序列，并合成所述目標基因，所述D-扁桃酸脫氫酶的基因序列如序列表SEQ IDNO.1所示，所述苯丙氨酸-4-羥化酶的基因序列如序列表SEQ ID NO.2所示，所述4-羥苯乙酸3-羥化酶的基因序列如序列表SEQ ID NO.3所示；

步驟二：PCR擴增步驟一中D-扁桃酸脫氫酶、苯丙氨酸-4-羥化酶和4-羥苯乙酸3-羥化酶的全長基因，將所得的基因片段分別連接到質粒上，轉入到細胞中，細胞做抗性篩選，然后逐級擴大培養并誘導蛋白表達，分別收集含有上述D-扁桃酸脫氫酶、苯丙氨酸-4-羥化酶和4-羥苯乙酸3-羥化酶的濕細胞，將收集的濕細胞高壓破碎、離心，在上清液中逐量加入硫酸銨直至蛋白固體析出；離心收集蛋白，純化，分別得到ManDH、PAH和HpaH液體酶；

步驟三：將步驟二制得的ManDH、PAH和HpaH液體酶與濃度為1-50mM的底物苯丙酮酸混合，并加入濃度為500～1500U的過氧化氫酶、甲酸鹽和濃度為0.5～3mM的輔因子NADH、濃度為0.05～0.4mM的DMPH₄、濃度為0.2～1mM的FAD，放入恒溫搖床中進行催化反應，反應條件為：溫度30～65℃、pH 6.0～8.0，時間8～20h，所得反應液即為含丹參素溶液；

其中，步驟三中所述ManDH、PAH和HpaH液體酶的濃度分別為5～10U、0.3～1U、20～40U；步驟三中用濃度為3～9U的甲酸脫氫酶(FDH；GenBank：EFW95288)進行NADH循環利用；步驟三中選用濃度為濃度為0.1～2mg的蝶呤-4a-甲醇胺脫水酶(PCD；GenBank：NP_213022)和濃度為0.1～2mg的二氫生物蝶呤還原酶(DHPR；GenBank：WP_011172549)進行DMPH₄循環利用。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的D-扁桃酸脫氫酶、苯丙氨酸-4-羥化酶和和4-羥苯乙酸3-羥化酶的編碼基因還包括：

(1)序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3分別所示的DNA分子；和/或；

(2)在嚴格條件下與(1)所述的DNA分子雜交且編碼權利要求1所述D-扁桃酸脫氫酶、苯丙氨酸-4-羥化酶和和4-羥苯乙酸3-羥化酶的DNA分子；和/或；

(3)與(1)或(2)所述的DNA分子具有80％以上同源性且編碼權利要求1所述D-扁桃酸脫氫酶、苯丙氨酸-4-羥化酶和和4-羥苯乙酸3-羥化酶的DNA分子。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的D-扁桃酸脫氫酶、苯丙氨酸-4-羥化酶和4-羥苯乙酸3-羥化酶的編碼基因分別來自于：嗜熱菌Thermococcus barophilus、Thermomonospora curvata和Sulfobacillus acidophilus。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟一中選用大腸桿菌DH5α菌株的D-扁桃酸脫氫酶、苯丙氨酸-4-羥化酶和4-羥苯乙酸3-羥化酶基因序列，設計引物并克隆。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟一中選用大腸桿菌BL21(DE3)菌株作為蛋白表達的宿主菌。