[發(fā)明專利]一種由SNP所引起利福平類抗生素耐藥的抗性基因的特異性引物的設(shè)計(jì)方法及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010719205.0
• 申請日: 2020-07-23
• 公開（公告）號: CN111808977B
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李炳;徐結(jié);梁賀彬;張家禹;雷華新
• 申請（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)深圳國際研究生院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/14;C12N15/11;C12R1/445
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 劉方

本發(fā)明提供一種由SNP所引起利福平類抗生素耐藥的抗性基因的特異性引物的設(shè)計(jì)方法及檢測方法，該設(shè)計(jì)方法包括以下步驟：步驟一、獲取抗性基因的核苷酸序列；步驟二、對核苷酸序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，生成候選引物；步驟三、根據(jù)候選引物的參數(shù)進(jìn)行篩選，得到特異性引物對。本發(fā)明實(shí)施例的設(shè)計(jì)方法至少具有如下有益效果：通過對引物參數(shù)的設(shè)定并進(jìn)行篩選，設(shè)計(jì)得到具有較高的特異性，設(shè)計(jì)得到的特異性引物對可以通過PCR擴(kuò)增直接得到抗性基因的全長序列，大大簡化操作步驟。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種由SNP所引起利福平類抗生素耐藥的抗性基因的特異性引物的設(shè)計(jì)方法及檢測方法。

背景技術(shù)

利福平為利福霉素類半合成廣譜抗菌藥，對金黃色葡萄球菌、結(jié)核分枝桿菌等多種病原微生物均有抗菌活性，主要應(yīng)用于肺結(jié)核和其他結(jié)核病的治療。近年來，由于結(jié)核病的發(fā)病率開始上升，利福平的濫用，造成環(huán)境中的利福平的含量逐年升高，這也導(dǎo)致環(huán)境中利福平耐藥菌株的檢出率顯著升高。

利福平通過與細(xì)菌DNA依賴的RNA聚合酶亞基特異性結(jié)合，抑制RNA聚合酶的活性，干擾細(xì)菌DNA的轉(zhuǎn)錄起始，阻礙蛋白質(zhì)合成從而發(fā)揮殺菌作用。RNA聚合酶由5個亞單位組成，其中的β亞單位由rpoB基因進(jìn)行編碼。rpoB基因突變是細(xì)菌的利福平類抗生素耐藥的主要機(jī)制。rpoB基因的少數(shù)密碼子發(fā)生突變后，其編碼的氨基酸改變，使RNA聚合酶分子原有的利福平結(jié)合點(diǎn)的構(gòu)象發(fā)生改變。利福平無法與RNA聚合酶分子結(jié)合，從而導(dǎo)致利福平耐藥，這在多種細(xì)菌中都得到了證實(shí)。

雖然90%左右的利福平耐藥菌株的突變發(fā)生在其利福平耐藥決定區(qū)（RifampinResistance?Determining?Region，RRDR），包括cluster?Ⅰ（507-533位氨基酸）、cluster?Ⅱ（563-572位氨基酸）等，但仍有不少突變位點(diǎn)位于利福平耐藥決定區(qū)以外。因此，獲取細(xì)菌的rpoB基因全長序列，并對其相應(yīng)的SNP位點(diǎn)分析就顯地尤為重要。然而，rpoB基因全長在3kb以上，屬于長片段基因序列。目前對于長片段基因序列的獲取主要通過克隆載體測序的方式，但存在操作復(fù)雜、耗時長等問題。而常規(guī)的PCR反應(yīng)對于3kb以上的DNA片段很難擴(kuò)增，即便擴(kuò)增成功但產(chǎn)量較低，難以進(jìn)行進(jìn)一步的檢測分析。因而，有必要提供一種能夠篩選利福平類抗生素耐藥的抗性基因的特異性引物的設(shè)計(jì)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明提出一種能夠篩選由SNP所引起利福平類抗生素耐藥的抗性基因的特異性引物的設(shè)計(jì)方法及檢測方法。

第一方面，本發(fā)明的一個實(shí)施例提供了一種由SNP所引起利福平類抗生素耐藥的抗性基因的特異性引物的設(shè)計(jì)方法，該設(shè)計(jì)方法包括以下步驟：

步驟一、獲取抗性基因的核苷酸序列；

步驟二、對核苷酸序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，生成候選引物；

步驟三、根據(jù)候選引物的參數(shù)進(jìn)行篩選，得到特異性引物對。

本發(fā)明實(shí)施例的設(shè)計(jì)方法至少具有如下有益效果：

通過對引物參數(shù)的設(shè)定并進(jìn)行篩選，設(shè)計(jì)得到具有較高的特異性，設(shè)計(jì)得到的特異性引物對可以通過PCR擴(kuò)增直接得到抗性基因的全長序列，大大簡化操作步驟。