[發明專利]DosH蛋白中提高蛋白有序性的氨基酸序列以及相關的突變位點和重組蛋白

有效

• 申請號: 202010717479.6
• 申請日: 2020-07-23
• 公開（公告）號: CN112940088B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 林敏;王勁;周正富;左開井
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/31;C12N15/70
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

DosH蛋白中提高蛋白有序性的氨基酸序列以及相關的突變位點和重組蛋白。本發明發現了一種提高蛋白有序性的氨基酸序列及該序列的幾個關鍵突變位點。實驗結果表明，通過對這些突變位點進行基因替換，分別得到的幾個重組蛋白能夠在逆境條件下保護酶的活性，并且可減少酶發生聚集，防止其結構發生改變。

技術領域

本發明涉及一種提高蛋白有序性的氨基酸序列以及相關的突變位點和重組蛋白及應用。

背景技術

冷凍和氧化等逆境是制約生物生長和發育的非生物脅迫因素，比如蛋白在逆境脅迫條件下往往會降低或失去活性。尤其是酶蛋白，容易發生聚集或結構的其它改變而失活。

因此，通過基因工程手段，得到能在逆境條件下保護蛋白活性的重組蛋白，很有必要。

發明內容

本發明的目的是通過提供一種提高蛋白有序性的氨基酸序列以及發現其相關的突變位點，得到具有抗逆保護功能的重組蛋白。

本發明發現，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的DosH蛋白在逆境脅迫條件下可保護酶的活性，并能減少酶發生聚集和阻止結構發生改變。

DosH蛋白由298個氨基酸組成，分子量為30.9kDa，富含親水性氨基酸，親水氨基酸含量為61％，是一類親水蛋白。

本發明對DosH蛋白進行一級結構分析發現，與其它典型的親水蛋白質比較，DosH蛋白顯著的特點是含有一個有序性升高的多肽(SEQ ID NO.2；N-DosH：1-103位氨基酸)，為Deinococcus屬特異序列，具有高度保守性，可能是DosH蛋白折疊成有序二級結構的關鍵區域。

本發明發現，在DosH蛋白中有幾個關鍵位點，亮氨酸(L)、色氨酸(W)、異亮氨酸(I)、谷氨酸(E)和賴氨酸(K)位點高度保守，且能夠促成蛋白形成二級結構。

其中，亮氨酸(L)、色氨酸(W)、異亮氨酸(I)3種氨基酸能夠促成蛋白形成有序二級結構；谷氨酸(E)和賴氨酸(K)促成蛋白形成無序二級結構。

本發明將DosH蛋白61位的W和75位的I突變為脯氨酸(P)，該突變蛋白命名為WIP(SEQ ID NO.3)；

將14-17位4個連續L、61位的W和75位的I突變為P，該突變蛋白命名為LWIP(SEQ IDNO.4)；

將6位的E、59位的K、62位的E突變為A，該突變蛋白命名為3A(SEQ ID NO.5)。

軟件預測突變后的蛋白，與DosH蛋白相比，有序性從高到低依次為3ADosHWIPLWIP。

進一步利用圓二色譜技術測定DosH及突變蛋白二級結構的有序性，結果顯示，3個蛋白的有序性分別為DosH：82.5％；WIP：62.2％；LWIP：51.4％，有序性與預測結果一致。

本發明表達了3A、WIP和LWIP重組蛋白，發現3個重組蛋白在逆境脅迫條件(液氮反復凍融和H₂O₂沖擊)下都有不同程度對酶的保護作用，證實以上提到的幾個位點是DosH蛋白的關鍵位點。

本發明進行的具體研究工作如下：

1、DosH、3A、WIP和LWIP重組蛋白表達載體的構建：

1)以本實驗室保存的重組質粒pET28a-DosH為模板，通過PCR擴增出目的基因(DosH、3A、WIP和LWIP)；

2)將DosH、3A、WIP和LWIP基因連接于pET28a表達載體上，構建完整基因重組質粒pET28a-DosH、pET28a-3A、pET28a-WIP和pET28a-LWIP；