[發明專利]一種熊去氧膽酸的制備方法

在審

• 申請號: 202010715401.0
• 申請日: 2020-07-23
• 公開（公告）號: CN112852911A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 陳曦;崔云鳳;馮進輝;卜丹丹;吳洽慶;朱敦明
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12P33/02
• 分類號: C12P33/02;C12P33/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

為了解決熊去氧膽酸的生物制備需要過量共底物來實現輔因子再生的問題，本發明通過在黃素還原酶的作用下，以核黃素為底物，實現了共底物的催化量加入，利用空氣中的氧氣作為底物大大降低了由鵝去氧膽酸氧化為7?羰基石膽酸的生產成本。以7?羰基石膽酸為底物，異丙醇為共底物，底物濃度可以有效提高。本發明為熊去氧膽酸的綠色生產提供了一條廉價的生物催化工藝。

技術領域

本發明涉及利用多種氧化還原酶作為催化劑，以鵝去氧膽酸為底物制備熊去氧膽酸，屬于生物工程領域。

背景技術

膽酸及其衍生物具有廣泛的生物活性，是內源性的天然產物。由于其本身高度的光學純度和兩親的分子的結構特點，生物活性研究一直是藥理學和藥物發現領域的研究熱點之一。膽酸類藥物己經在臨床上有應用，如熊去氧膽酸及牛橫熊去氧膽酸已用于肝臟疾病的治療(熊去氧膽酸聯合來適可治療脂肪肝合并高脂血癥患者的效果，魏鴻，2017，30,133)，。而近幾年來，膽酸及其衍生物的藥理活性研究取得了很大的突破，2015年，FDA批準了兩個膽酸類藥物上市，分別為用于治療膽汁酸合成障礙罕見病的Cholham膠囊(主要成分為膽酸)和用于頦下脂肪的溶脂針劑Kybella(主要成分為脫氧膽酸)。

傳統的熊去氧膽酸制備的文獻(NAD⁺-Dependent Enzymatic Route for theEpimerization of Hydroxysteroids,Fabio Tonin,Linda G.Otten,IsabelW.C.E.Arends, 2018,11,1-13；Flavin Oxidoreductase-Mediated Regeneration ofNicotinamide Adenine Dinucleotide with Dioxygen and Catalytic Amount ofFlavin Mononucleotide for One-Pot Multi-Enzymatic Preparation ofUrsodeoxycholic Acid,Xi Chen,Yunfeng Cui,Jinhui Feng, Yu Wang,Xiangtao Liu,Qiaqing Wu,Dunming Zhu,Yanhe Ma,2019,DOI: 10.1002/adsc.201900111)雖然是一鍋法進行，但是往往需要使用共底物來實現輔酶的再生。尤其是第一步的氧化過程中，往往需要過量的共底物加入推進反應的進行。

上式為鵝去氧膽酸制備熊去氧膽酸

發明內容

為了有效的降低從鵝去氧膽酸制備熊去氧膽酸的生產成本，本發明通過使用催化量的共底物加入，降低熊去氧膽酸的生產成本。

本發明的有益效果：通過更改輔酶再生方法，有效的降低了共底物的使用量從而降低了生成成本，為熊去氧膽酸的制備提供了一條廉價的制備方法。

具體實施方式

下面的實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。

本發明中使用的黃素還原酶基因來源于Mycobacterium goodii的核黃素還原酶(MFR)(GenBank:ABX11274.1)，7α-羥基甾體脫氫酶(7α-HSDH)基因來源于 Brevundimonassp.(GenBank:WP_046653274.1)，7β-羥基甾體脫氫酶(7β-HSDH)基因來源于Clostridiumsp.Marseille(GenBank:WP_066892209.1)，TB醇脫氫酶(TBADH) 基因來源于Thermoanaerobacter ethanolicus(GenBank:X64841.1)將上述構建到pET21a 或者pRSFDuet-1表達載體上。將重組質粒轉入宿主菌細胞(優選大腸桿菌BL21 (DE3))，獲得相應的工程菌株。將工程菌株接種至L-B培養基中，25℃培養16 小時。離心收集菌體，破菌留取上清液。

實施例1：黃素還原酶與7α-膽酸脫氫酶制備7-Keto-石膽酸