[發明專利]一種黑水虻抗菌肽的提取方法在審
| 申請號： | 202010708205.0 | 申請日： | 2020-07-22 |
| 公開（公告）號： | CN111876456A | 公開（公告）日： | 2020-11-03 |
| 發明（設計）人： | 劉德江;劉一 | 申請（專利權）人： | 劉德江 |
| 主分類號： | C12P21/06 | 分類號： | C12P21/06;C07K1/14;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C12N1/20;C12N1/14;A01K67/033;A23K10/12;A23K10/18;A23K10/26;A23K10/37;A23K50/90;C12R1/225 |
| 代理公司： | 唐山永和專利商標事務所 13103 | 代理人： | 張云和 |
| 地址： | 063000 河北省唐山市路*** | 國省代碼： | 河北;13 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 黑水 抗菌 提取 方法 | ||
1.一種黑水虻抗菌肽的提取方法，其特征在于，按下述步驟進行：
（1）按米曲霉制種方法制備一定量的米曲霉種子液，米曲霉種子液加入乳酸桿菌擴大培養24小時成為發酵液，發酵液中乳酸桿菌菌體密度2-4億個/升；
（2）用有機廢棄物制備黑水虻養殖料，有機廢棄物包括畜禽糞便、餐飲垃圾、蔬菜水果垃圾、作物秸稈；
（3）接種米曲霉種子液于黑水虻養殖料中，米曲霉種子液與黑水虻養殖料的質量比為1：10-20，制備成發酵養殖料；
（4）將黑水虻幼蟲投入步驟（3）制備的發酵養殖料中，控制養殖環境溫度25-32℃，濕度65-75%，養殖幼蟲達到5齡幼蟲；
（5）將步驟（4）養殖的黑水虻5齡幼蟲與發酵養殖料分離，將5齡幼蟲置于步驟（1）制備的發酵液中再養殖24小時，米曲霉和乳酸桿菌誘導黑水虻產生更多抗菌肽；
（6）將步驟（5）養殖24小時的幼蟲及發酵液一起置于膠體磨，粉碎均質10-20分鐘后置于恒溫反應器中，30℃下反應12-36小時得到降解液，米曲霉蛋白酶會將黑水虻部分大分子蛋白降解為小分子的類抗菌肽；
（7）將步驟（6）得到的降解液用10000轉/分，離心去除非蛋白雜質，得到降解物的上清液；
（8）降解物上清液以0.5mol/L三氯乙酸沉淀大分子蛋白，靜置30分鐘后10000轉/分再次離心，得到去大分子上清液；
（9）去大分子上清液用海藻酸過濾吸附，再用0.2mol/L鹽酸溶液洗脫吸附在海藻酸上的抗菌肽；
（10）將洗脫液用氫氧化鈉調解PH值為4.5后，用氯化鈉沉析，透析，脫鹽干燥得抗菌肽粗品；
（11）將抗菌肽粗品用超純水溶解，經過0.22μm-0.45μm超濾膜過濾，得到超濾液，冰凍干燥得目標抗菌肽。
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