[發明專利]鑒定禽腎炎病毒和雞傳染性貧血病毒的引物組及其應用

在審

• 申請號: 202010707560.6
• 申請日: 2020-07-21
• 公開（公告）號: CN111733292A
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發明（設計）人: 謝芝勛;張艷芳;鄧顯文;劉加波;謝志勤;張民秀;謝麗基;羅思思;曾婷婷
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 楊立華

本發明公開了鑒定禽腎炎病毒和雞傳染性貧血病毒的引物組，包括引物對Ⅰ和引物對Ⅱ，引物對Ⅰ由引物ANV?F和ANV?R組成，引物對Ⅱ由引物CIAV?F和CIAV?R組成；引物ANV?F、ANV?R、CIAV?F和CIAV?R分別具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.4的堿基序列。據此，發明人還建立了相應檢測鑒定方法并研制了對應試劑盒。本發明建立的二重PCR可用于快速檢測禽腎炎病毒和雞傳染性貧血病毒的混合感染，適于大批量檢測，既可節約成本和節省時間，又能減少污染，具有很高的實用價值。

技術領域

本發明屬于禽腎炎病毒和雞傳染性貧血病毒檢測技術領域，尤其涉及鑒定禽腎炎病毒和雞傳染性貧血病毒的引物組及其應用。

背景技術

禽腎炎病毒(Avian Nephritis Virus，ANV)是一種腸道病毒，主要感染雞，各齡期均可感染，但以侵害雛雞為主，并且在火雞、鴨子和鴿子身上均能檢出。該病毒主要引起一種以典型的亞臨診癥狀，雖致病力不強，但感染性強，能在雞群中迅速傳播，1976年首次在日本被發現，隨后其他國家陸續發生，廣泛見于世界各地，嚴重可表現為腸炎、腎損傷及生長發育不良等，與雞矮小綜合征有關。雞傳染性貧血病由雞傳染性貧血病病毒(Chickeninfectious anemia virus，CIAV)引起的一種傳染病，可引起3周齡以內的雞骨髓和全身淋巴組織萎縮，出現嚴重貧血、出血，進而導致雛雞發生免疫抑制。日本學者Yuasa等1979年首次發現并報道了CIAV，隨后的報道證實該病在世界范圍內均有分布，目前CIAV已在各種不同雞群中廣泛傳播，甚至在某些SPF雞群中也檢測到CIAV的存在。隨著雞年齡增長對CIAV的抵抗力增強，成年雞感染后不出現任何臨床癥狀，但種雞可將CIAV垂直傳播給其子代，引起子代發生傳染性貧血，臨床上CIAV感染雞群常伴發或繼發其他疾病，因此，利用各種方法加強對CIAV污染的監測對于種禽場防控CIAV也極其重要。

目前，實驗室診斷檢測上述兩種病原的方法以傳統的病毒分離、瓊脂擴散試驗、間接熒光試驗和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等為主，但這些檢測方法存在耗時長、敏感性低、標準化難等缺點，在實際應用中具有一定的局限性，因此，越來越多的學者致力于PCR檢測方法。

在臨床檢測中，常出現多種病原體混合感染，為了用于多種病原的鑒別診斷，迫切需要一種高通量、低成本、高效率的檢測方法進行批量快速檢測。二重(或多重)PCR采用多對引物同時擴增多個模板，克服了常規PCR的不足。但是，二重(或多重)PCR是在同一體系中存在多種模板和引物，復合擴增中引物之間、模板之間、引物與模板之間可能存在競爭抑制。因此有必要對各種條件進行優化，需要防止引物與模板間的非特異性結合，避免出現非特性條帶，同時要盡量避免產生引物二聚體。此外，目的片段要有合適的梯度，各引物退火條件盡可能一致，以確保兩種(或多種)擴增產物量的相對平衡。

與常規PCR相比，多重PCR具有可同時檢測、鑒別多種病原體的特點，在多種病原混合感染的鑒別診斷中具有獨特的優勢和很高的臨床實用價值，但目前尚無可快速鑒別診斷ANV與CIAV的多重PCR檢測方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供快速、高效、準確的鑒定禽腎炎病毒和雞傳染性貧血病毒的引物組，適于大批量檢測，既可節約成本和節省時間，又能減少污染，具有很高的實用價值。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

鑒定禽腎炎病毒和雞傳染性貧血病毒的引物組，包括引物對Ⅰ和引物對Ⅱ，引物對Ⅰ由引物ANV-F和ANV-R組成，引物對Ⅱ由引物CIAV-F和CIAV-R組成；引物ANV-F、ANV-R、CIAV-F和CIAV-R分別具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.4的堿基序列。

引物ANV-F、ANV-R、CIAV-F和CIAV-R的摩爾比為1:1:1:1。

上述引物組在PCR擴增中的應用，退火溫度為60.0℃。