[發(fā)明專(zhuān)利]一種人角膜上皮細(xì)胞的制備方法、其條件培養(yǎng)基及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010699887.3
• 申請(qǐng)日: 2020-07-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111979176B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉佳
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 深圳市中佳生物醫(yī)療科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/071
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/071;C12N5/0775
• 代理公司: 深圳新創(chuàng)友知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44223
• 代理人: 江耀純

1.一種人角膜上皮細(xì)胞的制備方法,其特征在于包括如下步驟：

hAMSCs原代、傳代培養(yǎng)及純化；角膜上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基制備；

用條件培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)hAMSCs成角膜上皮細(xì)胞；

角膜上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基制備包括：將處理后的兔角膜上皮和前彈力層置于小皿中，使角膜上皮面朝下；加入適量0.1-0.25％胰蛋白酶35-40℃條件下消化8-15分鐘，加入中和培養(yǎng)基中止消化，800-1200r/min離心2-8min，人無(wú)血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸；將細(xì)胞重懸液接種于35mm的小皿中，放入35-40℃、4-6％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2天換液；待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80％－90％，進(jìn)行傳代培養(yǎng)；復(fù)蘇第3代兔角膜上皮細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80％－90％，每20-30小時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)液，獲取P4-P6代條件培養(yǎng)基；

用人無(wú)血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基BM加30％-90％條件培養(yǎng)基CM培養(yǎng)方法將hAMSCs分化為人角膜上皮細(xì)胞。

2.如權(quán)利要求1所述的人角膜上皮細(xì)胞的制備方法,其特征在于，用人無(wú)血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基BM加55％-65％CM條件培養(yǎng)基培養(yǎng)方法將hAMSCs分化為人角膜上皮細(xì)胞。

3.如權(quán)利要求1所述的人角膜上皮細(xì)胞的制備方法,其特征在于，用條件培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)hAMSCs成角膜上皮細(xì)胞包括：條件培養(yǎng)基CM與人無(wú)血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基BM混合，分別配制成CM比例為30％-90％的培養(yǎng)基；取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代hAMSCs，PBS洗滌一遍，0.1-0.25％胰蛋白酶消化1-5分鐘，加入人無(wú)血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，800-1200r/min離心1-10min；棄上清，分別加入適量BM、30％、40％、60％、90％的CM，調(diào)整細(xì)胞濃度為0.8-1.2×10⁵個(gè)/mL；將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入80-100μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)2-5個(gè)復(fù)孔；細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)20-30h，每孔加入5-15μLCCK-8，于35-40℃避光條件下細(xì)胞孵箱中孵育1-3h。

4.如權(quán)利要求3所述的人角膜上皮細(xì)胞的制備方法,其特征在于，用條件培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)hAMSCs成角膜上皮細(xì)胞進(jìn)一步包括：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的原代hAMSCs洗滌一遍；加入適量0.1-0.25％胰蛋白酶，消化2-3min，一次性吸管輕輕吹打，使貼壁細(xì)胞完全脫離；(3)加入人無(wú)血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，800-1200r/min離心2-8min；(4)棄上清，分別加入適量BM、30％CM、60％CM、90％CM制成細(xì)胞懸液；(5)將細(xì)胞接種于放有爬片的24孔板中，分別命名為BM、30％CM、60％CM、90％CM，并在培養(yǎng)板表面做好標(biāo)記，每隔2天換液。

5.如權(quán)利要求1所述的人角膜上皮細(xì)胞的制備方法,其特征在于，hAMSCs原代、傳代培養(yǎng)及純化包括：采用改進(jìn)勻漿法結(jié)合酶消化和組織塊法提取hAMSCs。

6.一種條件培養(yǎng)基，其特征在于，采用如下方法制備：將處理后的兔角膜上皮和前彈力層置于小皿中，使角膜上皮面朝下；加入適量0.1-0.25％胰蛋白酶35-40℃條件下消化8-15分鐘，加入中和培養(yǎng)基中止消化，800-1200r/min離心2-8min，人無(wú)血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸；將細(xì)胞重懸液接種于35mm的小皿中，放入35-40℃、4-6％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2天換液；待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80％－90％，進(jìn)行傳代培養(yǎng)；復(fù)蘇第3代兔角膜上皮細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80％－90％，每20-30小時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)液，獲取P4-P6代條件培養(yǎng)基。

7.一種條件培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，包括：將處理后的兔角膜上皮和前彈力層置于小皿中，使角膜上皮面朝下；加入適量0.1-0.25％胰蛋白酶35-40℃條件下消化8-15分鐘，加入中和培養(yǎng)基中止消化，800-1200r/min離心2-8min，人無(wú)血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸；將細(xì)胞重懸液接種于35mm的小皿中，放入35-40℃、4-6％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2天換液；待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80％－90％，進(jìn)行傳代培養(yǎng)；復(fù)蘇第3代兔角膜上皮細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80％－90％，每20-30小時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)液，獲取P4-P6代條件培養(yǎng)基。