[發(fā)明專利]一種篩選鑒定脅迫應(yīng)答基因表達(dá)調(diào)控因子的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010699515.0
• 申請日: 2020-07-20
• 公開（公告）號: CN111944874B
• 公開（公告）日: 2023-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李先強(qiáng);姜昕;方云;許玫英
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心）
• 主分類號: C12Q1/66
• 分類號: C12Q1/66;C12N15/65
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 朱雙;劉明星

1.一種篩選和鑒定脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)調(diào)控因子的方法，其特征在于，包括以下步驟：

a.?將待篩選鑒定細(xì)胞懸浮于裂解緩沖液中，加入溶菌酶溶液混合均勻，放置10-20分鐘，離心分離上清，得到細(xì)胞裂解液；

b.?提取待篩選鑒定細(xì)胞基因組DNA，然后用限制性內(nèi)切酶Mnli消化處理，得到消化的基因組DNA；

c.?將步驟a制備的細(xì)胞裂解液、步驟b制備的消化的基因組DNA和結(jié)合緩沖液混合，待蛋白與DNA充分結(jié)合后，上樣到預(yù)先清洗的過濾分析柱上，離心棄去流出液，用過濾清洗緩沖液清洗多次，用洗脫緩沖液洗脫獲得蛋白結(jié)合DNA片段；

d.?將洗脫的蛋白結(jié)合DNA片段與適配子連接，用帶有XbaI序列的正向引物和帶有HindIII序列的反向引物，通過對各個(gè)5′適配子和3′適配子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用XbaI和HindIII消化并克隆至pACYC-Luc載體中產(chǎn)生對應(yīng)的文庫，轉(zhuǎn)化DH5α后，在Amp抗生素板上篩選抗性克隆；

e.?選取抗性克隆進(jìn)行脅迫誘導(dǎo)處理，收集細(xì)胞制備細(xì)胞裂解液并進(jìn)行熒光素酶活性測定，選擇大于2倍誘導(dǎo)的克隆，利用測序和常規(guī)生物信息分析方法進(jìn)一步鑒定克隆中的脅迫應(yīng)答基因表達(dá)調(diào)控因子；

所述的步驟d的適配子為如下所示8種：

AA5：5’-ATGGATAGGTCGGTGA-3’，3’A-TACCTATCCAGCCACT-5’;

AA3:?5’-GACGCACCTTGAGGC-3’?，3’A-CTGCGTGGAACTCCG-5’;

AG5:?5’-ATGGATAGGTCGGTGA-3’?，3’G-TACCTATCCAGCCACT-5’;

AG3:?5’-GACGCACCTTGAGGC-3’?，3’G-CTGCGTGGAACTCCG-5’；

AC5:?5’-?ATGGATAGGTCGGTGA-3’，3’C-TACCTATCCAGCCACT-5’;

AC3:?5’-GACGCACCTTGAGGC-3’?，3’C-CTGCGTGGAACTCCG-5’;

AT5:?5’-ATGGATAGGTCGGTGA-3’，3’?T-T?ACCTATCCAGCCACT-5’;

AT3:?5’-GACGCACCTTGAGGC-3’?，3’T-CTGCGTGGAACTCCG-5’；

5′適配子AA5、AG5、AC5和AT5用于連接DNA片段的5'端，3′適配子AA3、AG3、AC3和AT3用于連接DNA片段的3'端；所述的PCR擴(kuò)增是擴(kuò)增10個(gè)PCR循環(huán)；

所述的步驟a的裂解緩沖液含有10?mM?Tris-HCl、0.1?M?NaCl、1?mM乙二胺四乙酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%?聚乙二醇辛基苯基醚，pH?8.0；

所述的步驟a中加入溶菌酶溶液混合后溶菌酶在混合體系中的終濃度為0.25mg/mL；

所述的步驟c中將步驟a制備的細(xì)胞裂解液、步驟b制備的消化的基因組DNA和結(jié)合緩沖液混合，混合體系為：5μL細(xì)胞裂解液、15?μL?2×結(jié)合緩沖液、5μL消化的基因組DNA和5μLddH₂O；所述的結(jié)合緩沖液含有40mM?4-（2羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸、pH7.6、20mM硫酸銨、2mM二硫蘇糖醇、20mM?KCl和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%?Tween-20；

所述的細(xì)胞為大腸桿菌DH5α。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟c的過濾清洗緩沖液含有100?mM?Tris-HCl、2.5?mM?EDTA和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%?Tween-20，pH?7.6。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟c的洗脫緩沖液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%?SDS水溶液。