[發明專利]一種提升角蛋白酶異源表達的啟動子

有效

• 申請號: 202010699002.X
• 申請日: 2018-08-16
• 公開（公告）號: CN111763675B
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發明（設計）人: 史勁松;龔勁松;陶麗妍;許正宏;蘇暢
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/75;C12N1/21;C12N9/50;C12R1/125;C12R1/085;C12R1/10;C12R1/11;C12R1/07
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發明公開了一種提升角蛋白酶異源表達的啟動子，屬于工業生物技術領域。本發明成功構建了攜帶16種不同啟動子序列的角蛋白酶重組菌，其中7種能夠提高角蛋白酶表達量，PaprE啟動子改造重組菌的酶活水平最高，達到2605U/mL，相比對照菌提高20倍。在5L發酵罐上發酵液中角蛋白酶活力高達7176U/mL，是目前文獻報道重組角蛋白酶表達的最高水平，能更好地服務于實際應用。本發明為角蛋白酶的高效表達及產酶研究提供了一種有效策略。傳統基因工程改造通常需構建高通量篩選方法，進行大量文庫篩選，工作量大、周期長、成本高，該改造方法相比傳統方法極大的減小了工作量，提高了高表達效率。

本申請是申請號為：201810933416.7，申請日為：2018年8月16日，申請名稱為：一種角蛋白酶異源表達的啟動子及其應用的分案申請。

技術領域

本發明涉及一種提升角蛋白酶異源表達的啟動子，屬于工業生物技術領域。

背景技術

角蛋白是一種不溶性的結構蛋白，因二硫鍵和氫鍵的高度交聯而具有高穩定性。作為畜牧業、制革業和紡織業發展過程的副產品，每年均有大量的毛發棄置于自然界，對環境造成了巨大污染。目前，處理毛發主要通過高溫、高壓、酸、堿、氧化等物理化學方法進行降解，但這些方法會損耗角蛋白中有用的氨基酸，并且效率低、能耗高、污染大。角蛋白酶通過二硫鍵還原作用打開角蛋白中復雜的二硫鍵，進而通過蛋白水解作用實現角蛋白的降解。采用角蛋白酶降解角蛋白是一種綠色的降解過程，從經濟和環保的角度，這種對環境友好的生物處理方式具有廣闊的前景。

然而，總結已有研究來看，目前角蛋白酶的酶活及熱穩定性普遍較差。雖然已有很多不同微生物來源的角蛋白酶基因成功實現異源表達的文獻報道，但大部分基因工程菌的角蛋白酶表達水平一直未突破，使實現角蛋白酶的廣泛應用及滿足工業化大規模使用需求成為難點。近年來研究人員逐漸把研究重點轉移到角蛋白酶的異源高效表達上，基因工程改造手段是提高重組角蛋白酶表達水平的關鍵方法。Radha利用誘導型啟動子PxylA和PamyL實現了角蛋白酶在巨大芽孢桿菌中的高效表達，使重組酶的表達水平比對照菌高約3倍，酶活達到168.6U/mL(Radha S,et al.Bioresour Technol,2008,99:5528-5537)。Wang等人將多個拷貝數的角蛋白酶基因整合到地衣芽孢桿菌基因組上，構建了能穩定高產角蛋白酶的重組菌(Wang J J,et al.Biotechnol Bioeng,2004,87:459-464)。而通過啟動子改造實現角蛋白酶的高效表達目前仍未見任何文獻報道，這對于對實現角蛋白酶的深入和廣泛應用也具有重大意義。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供一種角蛋白酶異源高效表達的啟動子，提高角蛋白酶表達量和酶活。

本發明的第一個目的是提供一種啟動子，所述啟動子為角蛋白酶基因的啟動子，所述啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQID NO.13、SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16所示。

在本發明的一種實施方式中，所述角蛋白酶基因的核苷酸序列為如SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列，或與SEQ ID NO.17～19具有95％以上同源性的核苷酸序列。

本發明的第二個目的是提供一種含有上述的啟動子的表達載體。

在本發明的一種實施方式中，所述載體為適于芽孢桿菌表達的載體。

本發明的第三個目的是提供一種表達角蛋白酶的重組菌，所述重組菌含有上述的啟動子。

在本發明的一種實施方式中，所述重組菌的宿主包括但不限于枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、脆弱桿菌、克勞氏芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌。

本發明的第四個目的是提供一種上述重組菌的制備方法，包括如下步驟：