[發(fā)明專利]基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)變換的雙重信號放大AuNPs-DNA步行器及制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010698327.6
• 申請日: 2020-07-20
• 公開（公告）號: CN111808925B
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳憲;許珂
• 申請（專利權(quán)）人: 福州大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/682;C12Q1/6825
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學俊

1.基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)變換的雙重信號放大AuNPs-DNA步行器，其特征在于：包含AuNPs-DNA步行器、靶標mRNA，Cu²⁺；

所述AuNPs-DNA步行器，包括：AuNPs、步行鏈DNA鏈W、軌道鏈DNA鏈T、封閉鏈DNA鏈B；

所述步行鏈DNA鏈W：

5’-HS-(T)20GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACGTCAAGG-3’ ；

軌道鏈DNA鏈T：

5’-Cy5AAGTATGCCAAAGACACTCGCTTTTTCTTTCTAATACGGCTTACCTATCGGCATACTTTTTT-HS-3’，

封閉鏈DNA鏈B：

5’-AAAGCGAGTGTCTTTGGCATAAAAAGTCAAGGAAGTATGCCAAAGATTTCCTTGACGTTCTTTCT-3’ ；

所述靶標mRNA序列為5’- AAGTATGCCAAAGACACTCGC-3’。

2.如權(quán)利要求1所述的基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)變換的雙重信號放大AuNPs-DNA步行器的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）AuNPs的制備；

（2）AuNPs-DNA步行器的制備；

（3）靶標與AuNPs-DNA步行器反應(yīng)；

（4）熒光檢測；

所述的步驟（2）AuNPs-DNA步行器的制備具體步驟：

①向1.5 mL的離心管中加入80 μL、10 nM AuNPs溶液和28 μL的超純水，并加入12 μL的1wt .% SDS以提高AuNPs的分散性，室溫孵育15 min；

②向另一個1.5 mL的離心管中加入4 μL 10 μM 步行鏈DNA鏈W、 4 μL 100 μM 軌道鏈DNA鏈T和46 μL 超純水，混合，并加入6 μL 50mM TCEP以活化DNA鏈，室溫孵育15 min；

③將上述兩個離心管對應(yīng)的體系混合，再將40 μL、100 mM、10×、pH 7.4 PBS和180 μL超純水加入到體系中，孵育15 min；之后將400 μL 2 M NaCl加入到混合液中，為防納米金發(fā)生聚集，需要一邊逐滴加入NaCl，一邊劇烈震蕩混合液；之后將混合液孵育過夜；用含有0.01wt . %吐溫-20的1×PBS，12000 rpm離心15 min，吸棄上清液，取沉淀漂洗3次，去除未結(jié)合的核酸鏈；最后回溶到400 μL 含有0.01 %吐溫-20的1×PBS中；加入1 μL 100 μM的MCH，用于封閉金納米粒子表面上的非特異性結(jié)合位點，并室溫孵育60 min；之后再用含有0.01 %吐溫-20的1×PBS，12000 rpm離心15 min，吸棄上清液，取沉淀漂洗3次，去除多余的MCH；最后回溶到400 μL不含0.01 %吐溫-20的1×PBS中；向體系中加入100 μL 25 mMMgCl₂，100 μL 500 mM NaCl，60 μL 10×PBS和335 μL 超純水，并加入5 μL 10 μM 封閉鏈DNA鏈B，以確保步行鏈DNA鏈W被完全封閉，然后室溫中避光孵育過夜；用含有0.01%吐溫-20的1×PBS，12000 rpm 15 min，漂洗3次，去除未結(jié)合的核酸鏈，最終獲得DNA功能化的AuNPs；置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

所述靶標與AuNPs-DNA步行器反應(yīng)方法為：將不同濃度的靶標mRNA、終濃度1 nMAuNPs-DNA步行器以及終濃度0.5 μM Cu²⁺置于0.01%吐溫-20的1×PBS中，反應(yīng)80 min。