[發(fā)明專利]一種基于熒光PCR技術(shù)的志賀氏菌檢測(cè)和分型用引物組、試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010697181.3
• 申請(qǐng)日: 2020-07-20
• 公開（公告）號(hào): CN111662994B
• 公開（公告）日: 2023-06-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何培彥;陳中文;朱國(guó)英;燕勇;王恒輝;呂沈聰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 嘉興市疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 呂紀(jì)濤

本發(fā)明提供了一種基于熒光PCR技術(shù)的志賀氏菌檢測(cè)和分型用引物組、試劑盒及其應(yīng)用，屬于病原體檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。基于熒光PCR技術(shù)的志賀氏菌檢測(cè)和分型用引物組，包括志賀氏菌通用引物對(duì)、福氏志賀氏菌特異性引物對(duì)、宋內(nèi)志賀氏菌特異性引物對(duì)、鮑氏志賀氏菌特異性引物對(duì)和腸侵襲性大腸桿菌特異性引物對(duì)。上述引物組能與四種不同血清型的志賀氏菌發(fā)生特異性互補(bǔ)配對(duì)，同時(shí)根據(jù)是否有熔解曲線峰及熔解曲線峰的具體Tm值判定是否含有志賀氏菌以及志賀氏菌的具體血清型，同時(shí)擴(kuò)增出Tm值為84.3±0.2℃和87.9±0.2℃的熔解曲線峰表示檢測(cè)到腸侵襲性大腸桿菌，從而實(shí)現(xiàn)與志賀氏菌的區(qū)分。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病原體檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于熒光PCR技術(shù)的志賀氏菌檢測(cè)和分型用引物組、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

細(xì)菌性痢疾是由志賀氏菌屬引起的腸道傳染病，在世界范圍內(nèi)這仍然是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。志賀氏菌經(jīng)消化道感染人體，接觸感染了志賀氏菌的病人，飲用志賀氏菌污染的食物和水都可能引起感染。人對(duì)志賀氏菌比較敏感，低劑量(10～100個(gè))志賀氏菌即可導(dǎo)致典型的細(xì)菌性痢疾。細(xì)菌性痢疾的典型癥狀包括發(fā)熱、腹痛、腹瀉、里急后重等，嚴(yán)重的還可能導(dǎo)致菌血癥和感染性休克。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的估計(jì)，每年大約有1.65億人感染志賀菌，導(dǎo)致110萬人死亡。69％的死亡病例是5歲以下的兒童。雖然細(xì)菌性痢疾的死亡近年來在不斷下降，但是它仍是導(dǎo)致兒童死亡的主要原因。

志賀氏菌可分為四個(gè)血清型：福氏志賀氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌和痢疾志賀氏菌。雖然志賀氏菌的四個(gè)血清型均能引起細(xì)菌性痢疾，但是不同的血清型表現(xiàn)出各自獨(dú)特的流行病學(xué)特征。因此，了解志賀氏菌流行株的血清型，對(duì)于細(xì)菌性痢疾的防控十分重要。傳統(tǒng)方法可以通過血清凝集和生化實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)志賀氏菌和鑒定志賀氏菌的血清型，但是傳統(tǒng)方法操作過程復(fù)雜，一份樣本的檢測(cè)鑒定往往需要花費(fèi)數(shù)天。而且很多時(shí)候結(jié)果的判定往往依靠檢測(cè)人員的經(jīng)驗(yàn)，易受主觀因素影響。分子生物學(xué)技術(shù)具有快速，簡(jiǎn)便，結(jié)果判定相對(duì)客觀等優(yōu)點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)特別是熒光PCR技術(shù)越來越廣泛的應(yīng)用到致病微生物(包括志賀氏菌)的檢測(cè)和鑒定中。曾經(jīng)也有一些使用熒光PCR技術(shù)檢測(cè)志賀氏菌的報(bào)道。但是這些方法只能鑒定到志賀氏菌屬，血清型的鑒定仍需依靠傳統(tǒng)方法。因此，這些方法的使用具有很大的局限性。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種基于熒光PCR技術(shù)的志賀氏菌檢測(cè)和分型用引物組、試劑盒及其應(yīng)用，該引物組或試劑盒不僅能同時(shí)檢測(cè)志賀氏菌還能對(duì)其具體所屬血清型進(jìn)行鑒定。

本發(fā)明提供了一種基于熒光PCR技術(shù)的志賀氏菌檢測(cè)和分型用引物組，包括志賀氏菌通用引物對(duì)、福氏志賀氏菌特異性引物對(duì)、宋內(nèi)志賀氏菌特異性引物對(duì)、鮑氏志賀氏菌特異性引物對(duì)和腸侵襲性大腸桿菌特異性引物對(duì)；

所述志賀氏菌通用引物對(duì)包括核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示的下游引物；

所述福氏志賀氏菌特異性引物對(duì)包括核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示的下游引物；

所述宋內(nèi)志賀氏菌特異性引物對(duì)包括核苷酸序列如SEQ?ID?No.5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ?ID?No.6所示的下游引物；

所述鮑氏志賀氏菌特異性引物對(duì)包括核苷酸序列如SEQ?ID?No.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ?ID?No.8所示的下游引物；

所述腸侵襲性大腸桿菌特異性引物對(duì)包括核苷酸序列如SEQ?ID?No.9所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ?ID?No.10所示的下游引物。

本發(fā)明提供了一種基于熒光PCR技術(shù)的志賀氏菌檢測(cè)和分型用檢測(cè)試劑盒，包括所述引物組。

優(yōu)選的，所述檢測(cè)試劑盒還包括熒光PCR反應(yīng)用試劑。