[發明專利]一種交聯酶的制備方法

有效

• 申請號: 202010696371.3
• 申請日: 2020-07-20
• 公開（公告）號: CN111849960B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發明（設計）人: 周建芹;劉江云;胡明剛
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N11/18
• 分類號: C12N11/18;C12N9/10;C12N9/02
• 代理公司: 蘇州翔遠專利代理事務所(普通合伙) 32251
• 代理人: 陸金星

本發明公開了一種交聯酶的制備方法，將多酚氧化酶與谷氨酰胺轉氨酶溶液混合反應，獲得粒徑大小幾微米至幾十微米、活力大小不同的交聯酶微粒，通過過濾、離心等方式可以將制備得到的交聯谷氨酰胺轉氨酶從溶液中分離出來，制得的交聯酶用于蛋白質藥物分子的聚乙二醇(PEG)修飾等。交聯谷氨酰胺轉氨酶在使用過程中，容易回收、可以反復利用、不會對產物分離造成負擔，大大降低了生產成本。該方法交聯過程綠色環保、溫和高效、反應可控，而且不需要載體，也不需要對谷氨酰胺轉氨酶純化，還可以多種酶一起交聯固定化。

技術領域

本發明屬于生物化工技術領域，涉及一種交聯酶的制備方法。

背景技術

天然酶(例如谷氨酰胺轉氨酶)一般是溶解于水溶液中催化反應，反應結束后必須通過加熱、加酸堿等方法滅活酶，昂貴的酶無法回收、只能使用一次，是一種極大的浪費。谷氨酰胺轉氨酶(E.C.2.3.2.13)催化多肽鏈上谷氨酰胺轉氨殘基(酰基供體)與各種伯氨基(酰基受體)化合物(包括賴氨酸殘基)之間的酰基轉移反應，形成異肽鍵，從而實現蛋白質交聯或者修飾。谷氨酰胺轉氨酶催化蛋白質交聯，可以改善食品質地和功能，提高產品價值，因此已經被商業化用于食品加工過程。谷氨酰胺轉氨酶的另一個重要應用就是修飾蛋白質，如蛋白質藥物的聚乙二醇(PEG)修飾、糖基化修飾等，其作用是延長蛋白質藥物的半衰期、降低蛋白質藥物的免疫原性，從而提高蛋白質藥物的臨床療效。谷氨酰胺轉氨酶法修飾蛋白質藥物的特點是修飾位點高度特異性、反應溫和、對蛋白質藥物沒有損傷，因此是目前定點修飾蛋白質藥物最受關注、最重要的方法。游離谷氨酰胺轉氨酶修飾蛋白質藥物反應結束后，滅活處理不但是一種浪費，同時也會造成蛋白質藥物的變性。固定化酶，可以解決上述問題。所謂固定化酶就是將能溶解于溶液中的酶變成不溶性的酶，但保留其催化活力，結束反應時，通過過濾、離心等方式很容易地從溶液中分離出來，方便控制反應進程，實現酶的重復利用。交聯法是常用的固定化酶方法之一，通常是利用化學交聯劑(如戊二醛)將酶蛋白之間共價連接。交聯法固定化酶的優點是不需要載體、酶活力不會受到載體的影響。但是，化學交聯法，對酶分子產生化學損傷，會降低酶的催化能力，而且存在化學殘留。酪氨酸酶(E.C.1.14.18.1)和漆酶(E.C.1.10.3.2)都屬于多酚氧化酶家族。酪氨酸酶催化多肽鏈上酪氨酸殘基的酚羥基發生氧化反應生成鄰苯二酚，進而催化鄰苯二酚生成有活性的鄰苯二醌，鄰苯二醌之間發生自聚合或者與賴氨酸、組氨酸、半胱氨酸殘基等發生反應產生蛋白質交聯。漆酶催化多肽鏈上酪氨酸殘基氧化生成酚自由基，生成的自由基自發聚合導致蛋白質交聯。兩種酶都作用于酪氨酸殘基，但是對酪氨酸殘基位點的要求、反應機理存在差異。目前，研究者開始初步嘗試將酪氨酸酶和漆酶用于食品蛋白質交聯，改善食品品質、提高食品價值。總之，谷氨酰胺轉氨酶、多酚氧化酶都是可以催化蛋白質交聯的酶。在谷氨酰胺轉氨酶修飾蛋白質藥物的應用中，為了方便控制反應進程、實現酶的回收利用，需要一種溫和高效的酶促固定化方法對谷氨酰胺轉氨酶進行交聯固定化，但現有的公開方案中，未見有酶促谷氨酰胺轉氨酶固定化的報道。

發明內容

本發明目的是提供一種交聯酶的制備方法，利用多酚氧化酶的催化作用進行谷氨酰胺轉氨酶的酶促交聯，不需要載體，也不需要對谷氨酰胺轉氨酶純化，還可以多種酶一起交聯固定化。

本發明的技術方案是：

一種交聯酶的制備方法，該方法包括：

(1)將底物配制成蛋白質濃度為5-10mg/mL的第一溶液，將多酚氧化酶配制成濃度范圍為1-10mg/mL的第二溶液；

(2)將所述第一溶液與所述第二溶液混合，在溫度為20-50℃的條件下反應20min-24h后，離心、收集沉淀獲得交聯酶微粒。

進一步的，步驟(1)中，所述底物為一種多肽鏈中含有能夠被多酚氧化酶特異性催化的酪氨酸殘基的酶。

進一步的，步驟(1)中，所述底物為谷氨酰胺轉氨酶。

進一步的，步驟(1)中，所述多酚氧化酶為漆酶、酪氨酸酶中的任意一種。