[發明專利]一種檢測轉錄因子的熒光生物傳感器及其檢測方法和應用

在審

• 申請號: 202010693635.X
• 申請日: 2020-07-17
• 公開（公告）號: CN111979302A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 張春陽;張艷;李慶楠
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/6825
• 分類號: C12Q1/6825;C12Q1/6844;C12Q1/6883
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 宋海海

本發明提供一種檢測轉錄因子的熒光生物傳感器及其檢測方法和應用，屬于檢測分析技術領域。本發明提供一種基于雙向EXPAR和核酸內切酶IV輔助循環消化信號探針的超靈敏熒光策略來檢測轉錄因子，與常規EXPAR相比，雙向EXPAR可以在兩個方向上引發延伸反應，以生成豐富的觸發信號，從而提高了擴增效率。且該方法操作簡單、經濟、靈敏度高、背景低、特異性好、可以用該方法來實現對細胞中轉錄因子活性的超靈敏檢測，因此具有良好的實際應用之價值。

技術領域

本發明屬于檢測分析技術領域，具體涉及一種檢測轉錄因子的熒光生物傳感器及其檢測方法和應用。

背景技術

公開該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

轉錄因子可以通過與DNA雙鏈中啟動子/增強子特異性地結合來調節基因的表達。在轉錄因子的精確調控下，許多正常的生物學過程，例如細胞周期進程，細胞內維持代謝和生理平衡，細胞分化和發育等進程都可以有序的進行。然而，異常的轉錄因子表達水平可能導致一系列疾病，例如，轉錄因子核因子的過度和持續激活與癌癥、自身免疫性疾病和病毒感染等疾病密切相關。轉錄因子的表達水平不僅是疾病發展階段的重要指標，而且還是潛在的診斷標志物和治療靶標。因此，靈敏、準確地檢測轉錄因子的活性對于研究疾病的發病機理，臨床診斷和藥物發展具有的重要意義。

目前轉錄因子活性檢測的實驗中，傳統的凝膠電泳和放射自顯影檢測方法大都需要復雜的核酸標記和凝膠電泳程序，它們的靈敏度較低并且耗時費力。后期開發了轉錄因子活性檢測的新技術，包括采用雙熒光染料標記信號探針及設計雙莖環分子信標輔助檢測，以及最近又新出現的各種擴增策略，例如實時聚合酶鏈反應(PCR)，等溫指數擴增反應(EXPAR)，解旋酶依賴性擴增(HAD)和滾環擴增(RCA)等，但是這些方法需要對引物和/或模板進行特的殊設計，發明人發現，雖然這些方法能夠在一定的程度上檢測轉錄因子的活性并篩選其抑制劑，但是這些方法往往需要耗費很長的時間，需要進行嚴格的溫度控制及需要耗費大量的高濃度蛋白和探針，檢測的靈敏度仍有待提升。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供一種檢測轉錄因子的熒光生物傳感器及其檢測方法和應用。本發明提供一種基于雙向EXPAR和核酸內切酶IV輔助循環消化信號探針的超靈敏熒光策略來檢測轉錄因子。與常規EXPAR相比，雙向EXPAR可以在兩個方向上引發延伸反應，以生成豐富的觸發信號，從而提高了擴增效率。且該方法操作簡單、經濟、靈敏度高、背景低、特異性好、可以用該方法來實現對細胞中轉錄因子活性的超靈敏檢測，因此具有良好的實際應用之價值。

為實現上述技術目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明的第一個方面，提供一種檢測轉錄因子的熒光生物傳感器，所述熒光生物傳感器至少包括轉錄因子結合探針和信號探針；

其中，所述轉錄因子結合探針由p50-s探針與p50-antis探針雜化組成；所述p50-s探針與p50-antis探針3'端的磷酸二酯鍵均為硫代修飾；

所述轉錄因子結合探針至少包含一個特定的轉錄因子識別元件；

所述轉錄因子結合探針的5'突出端包含相同的序列，從而可作為等溫指數擴增反應(EXPAR)模板；

所述EXPAR模板均包含兩個重復序列和Nb.BtsI的識別位點，并且其可以以轉錄因子識別元件作為引物啟動延伸反應。

所述信號探針包含有一個嘌呤/嘧啶(AP)位點，且所述信號探針序列兩端設置有熒光基團和淬滅基團。

在本發明的一個實施例中，所述信號探針分別在3'和5'末端用BHQ1和FAM進行標記。

所述熒光生物傳感器還包括Exo III、Klenow片段聚合酶、Nt.BstI、Endo IV和dNTP。