[發明專利]一種家蠶絲心蛋白重鏈表達系統及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202010692467.2
• 申請日: 2020-07-17
• 公開（公告）號: CN111793645A
• 公開（公告）日: 2020-10-20
• 發明（設計）人: 趙愛春;郝占章;龍定沛
• 申請（專利權）人: 重慶西蠶生物技術研究院有限公司;西南大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;A01K67/04
• 代理公司: 重慶航圖知識產權代理事務所(普通合伙) 50247
• 代理人: 王貴君

本發明公開了一種家蠶絲心蛋白重鏈表達系統及其制備方法和應用，所述家蠶絲心蛋白重鏈表達系統含有目的基因表達框，所述表達框5’端為絲心蛋白重鏈啟動子3；用于表達蛋白后在絲腺及繭絲中的存在位置相同的結果，均存在于絲素層。結果表明C端截短后只要包含后20個氨基酸(倒數第20個是與絲素輕鏈形成二硫鍵的半胱氨酸Cys)就不會對成絲有影響。絲素C端的解析為蠶絲的成絲機理提供了實驗及理論基礎，有利于創造真正實用的家蠶絲腺生物反應器，保持蠶絲產業可持續發展，促進我國蠶學和昆蟲學科的長遠發展。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種家蠶絲心蛋白重鏈表達系統，還涉及該系統的 制備方法和應用。

背景技術

家蠶繭絲的主要組成是絲素(fibroin)和絲膠(sericin)兩種蛋白，其中絲素是繭絲的主 要成分，約占繭絲重的82％。絲素由家蠶的后部絲腺(PSG)細胞合成，絲膠由中部絲腺(MSG) 細胞合成，它們都在中部絲腺聚集，最后經過前部絲腺(ASG)被榨絲后而吐絲結繭。絲素 由350-kDa的重鏈蛋白(H-chain)，26-kDa的輕鏈蛋白(L-chain)和30-kDa的fibrohexamerin/P25(fhx)三種蛋白構成。這些蛋白在后部絲腺細胞內首先按照一定的比例 (H-chain：L-chain：fhx＝6：6：1)形成絲素基本單元，然后絲素基本單位被分泌到絲腺腔。 其中絲素基本單位由6個通過二硫鍵結合的重鏈、輕鏈(H-L)二聚體和1個P25糖蛋白分子組成。H-L二聚體在Fib-L的Cys-172和Fib-H的Cys-c20之間形成二硫鍵。一個P25糖蛋 白和六個H-L二聚體通過與重鏈的N端結構域(NTD)的非共價相互作用在內質網上形成絲 素基本單元。在絲素基本單位中重鏈蛋白是最主要的成分，達92％，并且是繭絲具有優良機械性能的原因所在，而輕鏈蛋白只占約7％，fhx約占1％。而絲素重鏈是由中間的12個結晶區域、11個非結晶區域和兩端保守親水的N端結構域(NTD)和C端結構域(CTD)組成。

自從家蠶基因組框架圖由中國家蠶基因組計劃研究小組領導的率先完成后，它不但確立 了我國家蠶功能基因組研究在國際上的地位，而且也為蠶絲業和昆蟲學科的發展提供了新的 契機。功能基因組時期的主要工作包括：主要功能基因的鑒定克隆，重要生物學性狀的分子 機理的闡明，最終實現重要經濟性狀的人為調節和創造。家蠶最重要的性狀是家蠶的絲腺能 在短時間高效地大量合成絹絲蛋白。利用家蠶絲腺的這一特點，在絲腺中高效表達外源蛋白 一直是許多蠶學和生物學科技工作者追求的目標。而目前對于成絲機理的研究仍有很多細節 需要科研工作者去解析，特別是在繭絲中占比最大且主要負責蠶絲機械性能的絲素重鏈其各 元件在絲形成過程中發揮著怎樣的作用更加需要進一步探究。

利用鱗翅目來源的轉座子piggyBac的家蠶胚胎顯微注射轉基因技術最初在日本取得成 功，而經過科研工作者的努力，我們也建立了系統而完善的家蠶胚胎顯微注射轉基因技術， 為本研究的工作開展打下了良好的基礎。在利用轉座子piggyBac的家蠶胚胎顯微注射轉基因 技術的研究報道中，已有關于絲素重鏈完整N端及完整C端(LBS)的報道，而有關利用家 蠶絲素重鏈表達系統(N端完整，C端含截短LBS)表達外源蛋白的方法未見報道，這也將 進一步探究了絲素重鏈元件之一C端的作用，為蠶絲成絲機理的研究提供實驗及理論基礎。 其中截短LBS(LBS_(s))：截短的輕鏈結合位點，包含絲素重鏈的c端20個氨基酸和多聚腺苷 酸信號序列(poly(A))。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種家蠶絲心蛋白重鏈表達系統；本發明的目的之二 在于提供含有所述家蠶絲心蛋白重鏈表達系統的重組載體；本發明的目的之三在于提供所述 重組載體的制備方法；本發明的目的之四在于提供所述家蠶絲心蛋白重鏈表達系統或所述重 組載體在絲素層表達活性蛋白中的應用。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：