[發明專利]用于評估微生物對環境中鉛離子解毒作用的生物檢定方法

有效

• 申請號: 202010692201.8
• 申請日: 2020-07-17
• 公開（公告）號: CN112143772B
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發明（設計）人: 賈曉強;李瑩
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;A01C1/02;C12R1/19
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

1.用于評估微生物對環境中鉛離子解毒作用的生物檢定方法；其特征是以本氏煙草為觀測對象，通過本氏煙草種子在含鉛微生物細胞懸液中的萌芽率以及本氏煙草幼苗在含鉛土壤中生長的生物量來反映微生物對環境中Pb²⁺的固定能力；

所述微生物包括野生型宿主菌E.coli?BL21(DE3)以及三株表面展示工程菌BL21(pR-FL)、BL21(pR691-FL)和BL21(pD-FL)；其中BL21(pR-FL)中的重組質粒pR-FL核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示；BL21(pR691-FL)中的重組質粒pR691-FL核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示；BL21(pD-FL)中的重組質粒pD-FL核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示。

2.如權利要求1所述的方法，其特征是，本氏煙草種子在含鉛微生物細胞懸液中的萌芽率表征步驟如下:

(1)受試微生物菌懸液制備:根據受試微生物對生長條件的要求，選擇LB培養基和IPTG作為蛋白誘導劑，誘導培養24h后用ddH₂O洗滌制成OD₆₀₀＝3的細胞懸液；

(2)Pb²⁺添加:分別在各個受試微生物細胞懸液和同等體積的蒸餾水中添加500-2000μM的Pb²⁺并混合均勻，制成各個受試微生物含鉛細胞懸液和不含微生物的Pb²⁺水溶液；

(3)種子排布:將預先滅菌并裁剪好的濾紙平放在無菌培養皿的底部，并將精確計數為50-100粒的本氏煙草種子均勻排布在濾紙上；

(4)煙草萌發:將步驟(2)中制備好的受試微生物含鉛細胞懸液和不含微生物的Pb²⁺水溶液分別添加至步驟(3)的培養皿中，使液面高度剛好覆蓋種子，然后將培養皿在白光照射下于25-28℃孵育；

(5)萌芽率計算:當種皮破裂可見時，認為種子已經萌發，計算種子的發芽率。

3.如權利要求1所述的方法，其特征是，本氏煙草幼苗在含鉛土壤中生長的檢定方法表征步驟如下:

(1)煙草種子萌發:在培養皿底部放無菌紗布，將本氏煙草種子均勻排布在紗布上，每天用ddH₂O噴灑，充分潤濕種子和紗布，將其置于室溫下萌發25-30天；

(2)受試微生物菌懸液制備:根據各個受試微生物對生長條件的要求，選擇LB培養基和IPTG作為蛋白誘導劑，誘導培養24h后制成OD₆₀₀＝3的細胞懸液；

(3)含鉛土壤的制備:先向步驟(2)中受試微生物細胞懸液和同等體積的蒸餾水中添加500-2000μM的Pb²⁺并混合均勻，制成受試微生物含鉛細胞懸液和不含微生物的Pb²⁺水溶液；然后將預先滅過菌的植物生長營養土與上述含鉛溶液以1∶1(v/w)的比例混勻，充分潤濕土壤，制成鉛污染的植物生長營養土；

(4)煙草植物培養:將步驟(1)的本氏煙草幼苗移栽至步驟(3)的營養土中，放在陽光充足的溫室里，每兩天澆水一次連續培養20-50天；

(5)植株稱重:將植株從盆中取出，處理干凈根部的泥土，稱量植株生物量。

4.如權利要求3所述的方法，其特征是，步驟(3)中，植物生長營養土采用高溫高壓蒸汽滅菌法，條件為121℃滅菌20min，然后在55-65℃烘箱中放置24h以充分烘干土壤。

5.如權利要求1所述的評估微生物對環境中鉛離子解毒作用的生物檢定方法在鉛離子污染環境的原位修復中的應用。