[發明專利]一種熒光定量PCR無創鑒別中華鱉偽雌鱉的方法

在審

• 申請號: 202010691194.X
• 申請日: 2020-07-17
• 公開（公告）號: CN111662965A
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發明（設計）人: 張君;趙陽;周偉尚;喬丹;章紀龍
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 合肥和瑞知識產權代理事務所(普通合伙) 34118
• 代理人: 魏玉嬌

本發明涉及生物信息技術領域，公開了一種熒光定量PCR無創鑒別中華鱉偽雌鱉的方法。具體步驟是，設定一對中華鱉偽雌鱉性別鑒定引物組，包括以目的基因18S rRNA和Gapdh的DNA序列設計的引物對。熒光定量PCR數據處理采用2^–ΔΔCt法，以Gapdh為內參基因，計算18S rRNA在基因組中的相對拷貝數。利用18S rRNA在中華鱉W染色體上的DNA序列拷貝數比Z染色體上的高，篩選出性腺為卵巢、基因型為ZZ型的中華鱉偽雌鱉。本發明的鑒別方法使熒光定量PCR技術用于中華鱉性別鑒定，只需微量血液即可檢測，無創采集中華鱉尾部血液對中華鱉健康無影響，具有高效、靈敏度高、穩定性好、特異性強的特點，解決了中華鱉偽雌鱉鑒別上的空白，有利于全雄鱉苗種繁殖，提高養殖效益。

技術領域

本發明涉及生物信息技術領域，尤其涉及一種熒光定量PCR無創鑒別中華鱉偽雌鱉的方法。

背景技術

中華鱉(Pelodiscussinensis)俗稱甲魚，是我國重要的名貴水產養殖品種。中華鱉雄鱉比雌鱉生長速度快，裙邊寬厚，脂肪少，價格高，因此開展中華鱉全雄苗種單性養殖可以顯著提高經濟效益，對中華鱉養殖產業發展具有重大意義。

正常發育中華鱉性別決定屬雌性異配型，即雌鱉性染色體為ZW型，雄鱉性染色體為ZZ型。對早期中華鱉鱉蛋進行17β-雌二醇藥物處理，可以誘導中華鱉未分化的性腺向雌性性腺發育，產生中華鱉性腺為卵巢基因型為ZZ的偽雌鱉。篩選出中華偽雌鱉(ZZ)與原系中華鱉雄鱉(ZZ)進行繁殖，能夠實現全雄鱉繁殖。但偽雌鱉從外觀上與正常發育中華鱉雌鱉并無較大差異，難以從表觀形態對中華鱉偽雌鱉進行鑒別。

公開號為CN108588237B的專利文獻公開了一種利用Z和W染色體上基因組序列的不同，來鑒別中華鱉性別的方法，這種鑒別方法提取中華鱉肝臟組織，造成中華鱉死亡。而且，性別連鎖基因引物是通過普通PCR檢測，特異性相對要低一些，容易產生二聚體，對結果判定有一定的干擾。此外，普通PCR擴增反應時間較長，PCR產物需要進行電泳檢測，降低了檢測效率。

發明內容

本發明要解決的技術問題為克服現有技術中的不足之處，提供一種熒光定量PCR無創鑒別中華鱉偽雌鱉的方法；

為了解決本發明的技術問題，所采取的技術方案為一種熒光定量PCR無創鑒別中華鱉偽雌鱉的方法，設定一組中華鱉偽雌鱉性別鑒定引物對，包括一對目的基因18S rRNA和內參基因Gapdh，采用熒光定量PCR反應，利用目的基因18S rRNA在W和Z染色體上DNA拷貝數的不同將偽雌鱉篩選出來，所述目的基因18S rRNA和內參基因Gapdh引物均包括F和R兩條引物，所述目的基因18S rRNA和內參基因Gapdh的引物序列如下所示：

作為上述熒光定量PCR無創鑒別中華鱉偽雌鱉的方法進一步的技術方案：

優選的，鑒別中華鱉偽雌鱉的具體步驟為：

S1、取50只以上確定性別為雄性的中華鱉血液DNA，每只個體采用20μL PCR反應液體系設置一組反應管，每組反應管中分別加入目的基因18SrRNA和內參基因Gapdh引物對，每個目的基因18S rRNA和內參基因Gapdh做3個平行重復孔，進行熒光定量PCR擴增，計算目的基因18S rRNA相對拷貝數；

S2、從步驟S1的雄性中華鱉中選取一只作為對照樣本A，設定對照樣本A的18SrRNA相對拷貝數為1，計算其他雄性中華鱉個體18S rRNA相對拷貝數相比于A的相對值，得到所有雄性中華鱉18S rRNA相對拷貝數的相對值，求所有雄鱉相對值的平均值和標準差SD，以作為閾值；