[發(fā)明專利]氧化石墨烯-達托霉素∕表皮生長因子復合敷料制備及創(chuàng)面愈合方法

在審

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• 申請日: 2020-07-15
• 公開（公告）號: CN111744050A
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發(fā)明（設計）人: 周代君;李東;張濤;彭晶晶;李華
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院
• 主分類號: A61L15/26
• 分類號: A61L15/26;A61L15/18;A61L15/44;A61L15/46;A61L15/42
• 代理公司: 重慶宏知億知識產(chǎn)權代理事務所(特殊普通合伙) 50260
• 代理人: 梁山丹

1.氧化石墨烯-達托霉素/表皮生長因子復合敷料制備，其特征在于，包括如下步驟：

S1準備A組氧化石墨烯膜：氧化石墨烯膜購買自南京先鋒納米有限公司，貨號：100027，CAS號：7440-44-0，參數(shù)：尺寸:9x9cm厚度：約25微米；

S2制備氧化石墨烯-多巴胺膜：

S21在100mL去離子水中加入131.14g tris鹽酸溶解，得到的tris溶液中加入多巴胺粉200mg，得到tris-多巴胺溶液，濃度為2mg/mL,pH值為8.5；

S22將S1中的氧化石墨烯膜浸泡在上述溶液中12h后，將混合物轉移到振動篩中，在37℃下以100r/min的速度振動；

S3制備B組氧化石墨烯-達托霉素樣品：

先將達托霉素粉溶解于去離子水中，制備10mg/mL的達托霉素水溶液，再將S1中的氧化石墨烯樣品，經(jīng)去離子水仔細清洗，孵育在達托霉素水溶液中，其中孵育溫度37℃；震動速度:100r/min；孵化時間,12h；

S4制備C組氧化石墨烯膜-表皮生長因子：將S2中制備好的氧化石墨烯-多巴胺膜，溶解在10μg/ml的表皮生長因子溶液中，孵育溫度37℃；震動速度:100r/min；孵化時間,12h；

S5制備D組氧化石墨烯膜-達托霉素/表皮生長因子：將氧化石墨烯膜-多巴胺加入到S3和S4步驟中相同濃度的達托霉素+表皮生長因子混合物中，孵育溫度37℃；震動速度:100r/min；孵化時間,12h，制備得氧化石墨烯膜-達托霉素/表皮生長因子膜。

2.氧化石墨烯-達托霉素/表皮生長因子復合敷料的表征及其對創(chuàng)面愈合的影響，包括如下步驟：

S1掃描電鏡觀察材料表面結構：將A組和D組樣品進行噴金，并徹底干燥，然后用掃描電鏡儀器在真空中觀察得到的薄膜，詳細地拍攝孔徑結構；

S2傅里葉紅外光譜觀察材料合成成分：將制備的樣品在600cm^-1-4000cm^-1波數(shù)范圍內(nèi)，通過傅里葉紅外光譜測量表征其化學結構；

S3接觸角測試儀觀察材料親疏水性：ABCD四組樣本被放置水平，每個材料表面均滴1μL去離子水，封閉靜置12h，用形成的液滴測量接觸角，每個樣品測試三次，得到平均角度值；

S4評估材料體外抗菌性：將大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)菌體培養(yǎng)、擴增至1×10⁹CFU/mL的密度，再經(jīng)LB稀釋至1×10⁴CFU/mL的密度，提取100mL菌液。采用96孔板，將ABCD每個樣本放置3個孔，每孔滴入200μL菌液，孵化24小時，37℃孵化溫度。采用分光光度計評估菌液變化，細菌原液標準OD值設為0.7，24h后再次行OD值檢測，觀察不同材料對細菌原液影響；

S5評估材料體外細胞毒性：原代成纖維細胞來源于正常的新生小鼠，并進一步將細胞傳代至第二代和第三代。采用96孔板進行細胞計數(shù)及培養(yǎng)，2000個細胞/孔，將每組樣品與血管內(nèi)皮細胞共同培養(yǎng)，每組3孔，第1、3、5、7天依次檢測，37℃條件下孵化后加上LB培養(yǎng)基溶液中(150μL/孔)，上述操作一式三份；

S6評估材料促細胞遷移能力：將血管內(nèi)皮細胞接種于24孔板(2×10⁴/孔)后，使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，使用槍頭劃出一道劃痕，并記錄時間為0h，將ABCD四組材料與該細胞進行共培養(yǎng)，用活細胞工作站顯微鏡進行24小時觀察，在單個實驗中，每組設置6個重復，使用ImageJ1.48V軟件(美國NIH公司)進行具體測量，上述操作一式三份；

S7小鼠創(chuàng)面模型建立及不同材料對創(chuàng)面愈合影響：小鼠的腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(1％,70μL/g)麻醉，然后使用打孔器建立全層皮膚缺損模型，缺損面積直徑0.6厘米，每個創(chuàng)面滴加細菌溶液(5μL10⁸/毫升)培養(yǎng)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，用75％的酒精對材料進行消毒，用磷酸緩沖鹽溶液漂洗徹底去除雜質，然后，在傷口上涂上準備好的薄膜，然后用粘膠毛巾固定，傷后1、3、5、7天拍照更換材料，采用山東貝諾醫(yī)藥生物科技有限公司【國家發(fā)明專利號ZL200620082586.1】采購的市售甲殼素敷料(CCD)作為陽性對照；

S8創(chuàng)面愈合計算：比較創(chuàng)面愈合前后創(chuàng)面面積，計算愈合率，采用IPP6.0軟件輔助，根據(jù)“感興趣區(qū)域”(AOI)功能選擇目標創(chuàng)面面積，我們用“大小計數(shù)”方法測量像素面積，傷口面積可按傷口愈合率＝(創(chuàng)面面積-愈合一定時間后的創(chuàng)面面積)/創(chuàng)面面積×100％的公式計算；

S9通過Origin軟件，采用單因素方差分析和雙因素方差分析分別分析兩組之間和兩組以上的顯著性差異，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，P0.05被認為有統(tǒng)計學意義。