[發明專利]一種脂肪酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 202010675890.1
• 申請日: 2020-07-14
• 公開（公告）號: CN111909913B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 倪忠;王安林;康凌宇
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P41/00;C12P7/40;C12R1/19
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本發明涉及一種脂肪酶突變體及其應用，特別涉及一種對于洛爾類藥物手性折分活性提高的脂肪酶及其應用，屬于基因工程技術領域。本發明的脂肪酶突變體是在枯草桿菌脂肪酶的第十二位氨基酸序列間插入一段無規卷曲氨基酸序列，從而使得到的脂肪酶突變體在不同條件下水解活性分別提高，對于非甾體抗炎藥物的手性拆分性能E值相較于野生型有了很大的提高，適合于工業化應用。

技術領域

本發明涉及一種脂肪酶突變體及其應用，特別涉及一種對于洛爾類藥物手性折分活性提高的脂肪酶及其應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

構成有機體的物質大多具有一定的空間構型，如自然界中存在的糖為D構型，組成蛋白質的二十幾種氨基酸都是L構型。手性分子和受體之間的相互作用表現出獨特的生物活性。手性藥物（單一對映體藥物）在人體內通過與生物大分子間相互手性匹配和分子識別而發揮治療作用，手性藥物的不同對映體在人體內的藥理活性、代謝過程及毒性存在顯著差異，如S-構型具有高的生理活性或藥理作用，而R-構型活性低或無活性。因此，手性藥物的研究和開發，已經成為當今新藥發展的重要方向和熱點領域。

非甾體抗炎藥（Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs，NSAIDs）是一類不含有甾體結構的抗炎藥，這類藥物包括阿司匹林、對乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、萘普酮、雙氯芬酸、布洛芬、尼美舒利、羅非昔布、塞來昔布等，其中手性純的布洛芬，酮洛芬和萘普生較為常見。而化學法生產手性純藥物由于其成本高，環境不友好等缺點，制約手性藥物臨床應用。而酶，作為一類的特殊的催化劑，相比于化學催化劑，具有先天的高區域選擇性和立體選擇性特點，在工業上適用于催化生產立體選擇性的化合物。

目前酶在該領域的應用，一般是在一定條件下，以酶去催化一個對映體發生反應成為不同的化合物，而使兩個對映體分開；也有學者對固定化酶進行純化并對藥物進行酶法拆分。由于酶催化立體選擇性強、反應條件溫和、副反應少、產率高、且不會造成環境污染備受關注；但是同時也存在局限性，合適的酶的篩選比較困難、野生型酶的活性較低、選擇性差的缺陷。

發明內容

本發明的目的是提供一種脂肪酶突變體及其應用，具體的是一種對于洛爾類藥物手性折分活性提高的脂肪酶及其應用。

本發明中，將枯草桿菌來源的堿性脂肪酶A（BLSA）作為母體，在此基礎上，通過分子模擬技術，根據此酶的高級結構特點，在此酶的活性口袋上方添加一段無特定的結構的氨基酸序列，以期該段序列不僅能保護酶的活性中心，而且還能提高該重組酶在手性拆分反應中的立體選擇性。

本發明首先提供一種脂肪酶突變體，所述脂肪酶突變體是在如SEQ.ID.NO.1所示氨基酸序列的脂肪酶上，在第十二位處插入一段如SEQ.ID.NO.2所示的無規卷曲序列；所得到的脂肪酶突變體的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

SEQ.ID.NO.1：

AEHNPVVMVHGIGGASFNFAGIKSYLVSQGWSRDKLYAVDFWDKTGTNYNNGPVLSRFVQKVLDETGAKKVDIVAHSMGGANTLYYIKNLDGGNKVANVVTLGGANRLTTGKALPGTDPNQKILYTSIYSSADMIVMNYLSRLDGARNVQIHGVGHIGLLYSSQVNSLIKEGLNGGGQNTN

SEQ.ID.NO.2：

ISHLKSKKGQSTSRHKKLRVKTE

SEQ.ID.NO.3：