[發(fā)明專利]人MED12基因突變的數(shù)字PCR檢測(cè)方法及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010675646.5
• 申請(qǐng)日: 2020-07-14
• 公開（公告）號(hào): CN113930486A
• 公開（公告）日: 2022-01-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 江螢;童慧娟;黃昕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 銘熾生物科技（上海）有限公司;銘時(shí)醫(yī)療科技（寧波）有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6858
• 分類號(hào): C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 上海一平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31266
• 代理人: 徐迅;高一平

本發(fā)明提供了一種人MED12基因突變的數(shù)字PCR檢測(cè)方法及應(yīng)用。具體地，提供了優(yōu)選的針對(duì)MED12 G44所在序列的引物對(duì)、擴(kuò)增方法、核酸探針以及檢測(cè)體系，進(jìn)一步還提供了用于檢測(cè)MED12基因突變的試劑盒。本發(fā)明通過優(yōu)化的引物對(duì)和探針以及相應(yīng)反應(yīng)條件，從而可以對(duì)不同樣本高靈敏度、強(qiáng)特異性地檢測(cè)MED12基因突變。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，涉及人MED12基因突變的數(shù)字PCR檢測(cè)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

MED12(Mediator complex subunit 12,MED12)基因位于X染色體上，人的 MED12基因是由45個(gè)外顯子構(gòu)成，長(zhǎng)度約為25000bp。MED12在生理情況下通過調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化等功能。因此，一旦MED12 基因序列發(fā)生突變，將會(huì)導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。

子宮肌瘤是婦科常見的良性腫瘤，子宮肌瘤最主要的臨床表現(xiàn)是異常子宮出血、盆腔痛和貧血，其對(duì)女性生活質(zhì)量的影響不容忽視。國(guó)外有研究報(bào)道子宮肌瘤中中介體復(fù)合物亞基12(Mediator complex subunit 12,MED12)基因的高頻突變，其中約70％的子宮肌瘤患者病灶組織中存在該基因突變，且大部分(90％)位于 MED12基因的第44位甘氨酸(MED12 p.G44)。

目前，已經(jīng)在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了MED12突變，除了子宮肌瘤，還在乳腺纖維上皮腫瘤中發(fā)現(xiàn)MED12基因突變。

研究發(fā)現(xiàn)，MED12突變陽性的子宮肌瘤通常與漿膜下型相關(guān)，其腫瘤數(shù)目與胎次成反比；而無MED12突變的子宮肌瘤，其數(shù)目和盆腔炎病史相關(guān)。此外，MED12 陽性突變的子宮肌瘤比陰性的病變體積更小，組織病理學(xué)上更常規(guī)。因此，針對(duì) MED12的突變檢測(cè)，能幫助臨床醫(yī)生更好地對(duì)子宮肌瘤進(jìn)行分類，預(yù)測(cè)腫瘤數(shù)目、組織形態(tài)。

盡管目前市場(chǎng)上還沒有針對(duì)MED12突變的腫瘤靶向藥，但是不排除未來有相關(guān)藥物產(chǎn)生的可能，對(duì)相關(guān)腫瘤MED12突變的檢測(cè)，有助于未來指導(dǎo)用藥等治療手段。

盡管腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞學(xué)樣本是突變檢測(cè)的最佳樣本，但此類樣本獲取難度大。檢測(cè)血漿中的游離核酸(Circulating free DNA,簡(jiǎn)稱“cfDNA”),又稱“液體活檢”，避免了需要腫瘤組織的活檢，在臨床上是一種非常有用的診斷應(yīng)用。使用液體活檢提供了重復(fù)采血的可能性，從而允許在腫瘤發(fā)生過程中或者癌癥治療期間追蹤cfDNA的變化，進(jìn)而監(jiān)控病情變化。

然而，采用無細(xì)胞的核酸(如cfDNA)作為腫瘤患者中的生物標(biāo)志物存在一定難度，尤其是應(yīng)用cfDNA檢測(cè)準(zhǔn)確并特異地檢測(cè)基因突變目前存在巨大的技術(shù)挑戰(zhàn)。首先，血液中的cfDNA含量因人而異，而且大部分情況都非常低,而其中腫瘤來源的游離核酸(Circulating tumor DNA,簡(jiǎn)稱“ctDNA”)的質(zhì)量更是參差不齊、含量高低不一。

不僅如此，cfDNA檢測(cè)方法特異性有待提高。Douillard等人報(bào)道，使用血漿檢測(cè)EGFR突變與腫瘤組織檢測(cè)結(jié)果的符合度僅為65％。

此外，目前雖然有一些基于cfDNA來檢測(cè)MED12基因突變的方法，但是這些方法的靈敏度和特異性尚難以令人滿意。

因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)基于cfDNA的高靈敏度和高特異性檢測(cè)RAS基因突變的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于cfDNA的高靈敏度和高特異性檢測(cè)MED12 基因突變的方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于檢測(cè)基因突變的試劑，所述試劑包含用于檢測(cè)MED12 G44突變的第一引物對(duì)，其中第一引物對(duì)包括SEQ ID No:1和 2所示的引物。

在另一優(yōu)選例中，所述的MED12 G44所在序列位于NG_012808.1：5786～5882。