[發明專利]一種適合于南部海區常見硨磲種類鑒定的通用單引物、試劑盒和鑒別方法

有效

• 申請號: 202010675134.9
• 申請日: 2020-07-14
• 公開（公告）號: CN111763747B
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 馬海濤;高紅梅;喻子牛;張躍環
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;朱聰聰

本發明公開了一種適合于南部海區常見硨磲種類鑒定的通用單引物、試劑盒和鑒別方法。本發明建立了利用多條下游引物競爭性退火的通用單引物多重PCR檢測和鑒別5種我國南部海區常見硨磲科物種(無磷硨磲、鱗硨磲、長硨磲、諾瓦硨磲和硨蠔)的方法，并經實際樣本測試，具有方法簡單、結果直觀、準確有效、不受環境及發育時期影響、成本低廉等優點。

技術領域：

本發明屬于水產生物中的分子鑒別技術領域，具體涉及一種利用通用單引物多重PCR技術快速鑒定我國南部海區常見硨磲種類的PCR試劑盒及其鑒別方法。

背景技術：

硨磲隸屬于軟體動物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)，簾蛤目(Veneroida)，硨磲科(Tridacnidae)，是一類熱帶大型海洋珊瑚礁底棲貝類，也是海洋中最大的雙殼貝類。硨磲與其他雙殼貝類的最大區別是發育變態到稚貝期階段與蟲黃藻建立了共生關系，其生長所需的大部分營養來自于蟲黃藻的光合作用，這一特性使硨磲可以直接利用熱帶海域的無機營養鹽，從而使硨磲具有較高的生態價值。另外硨磲也屬于高經濟價值物種，是熱帶海洋生物和漁業經濟的物質基礎，提供水族觀賞、工藝材料、水產食品等資源。

不同硨磲的成體間主要通過比較殼上的放射肋、稜鱗的數量和分布以及外套膜的花紋等特征來進行鑒定，但貝殼具有較強的可塑性，在發育過程中存在中間形態和中間生境，造成硨磲科不同種難于區分。另外在硨磲幼體發育階段，形態特征十分相似，更加難于區分。目前主要是基于COI、16S rDNA線粒體基因序列差異的分子生物學被用于硨磲種間鑒定，但這些基因序列之間差異比較小，難以用電泳等簡單方法進行區分。急需一種簡單高效的方法對我國南部海區常見硨磲種類個體進行大規模物種鑒定。

通用單引物多重PCR(common single primer multiplex polymerase chainreaction，CSP-M-PCR)是在一個PCR體系中加入一條通用性引物和多條特異性引物，只有含有與特異性引物配對的序列才能被擴增出來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離，然后與標準片段大小作比較，從而對物種進行鑒定。通用單引物多重PCR具有高效、快速、節約、鑒定結果十分可靠的特點，在物種鑒定的方面廣泛運用。

發明內容：

本發明目的是提供一種適合于我們南部海區常見硨磲科物種無磷硨磲、鱗硨磲、長硨磲、諾瓦硨磲和硨蠔鑒定的通用單引物、多重PCR試劑盒及其方法。本發明中利用該方法對無磷硨磲、鱗硨磲、長硨磲、諾瓦硨磲和硨蠔各40個個體進行了分析并發現鑒定效果顯著。

本發明的適合于我們南部海區常見硨磲科物種無磷硨磲、鱗硨磲、長硨磲、諾瓦硨磲和硨蠔鑒定的通用單引物，具體如下：

上游引物F1:ATTGTAGAGCATCATTCAGG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

下游引物R1:TCCAACTGTAAATAAACCAAC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

下游引物R2:TAATGGAAATGGGCTACTACG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

下游引物R3:TAAGTGGCCCCTCAACTGAAG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

下游引物R4:CGTGGCATGCCTGACAGA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

下游引物R5:TATCTACGTCTAACCCTACC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本發明的第二個目的是提供一種快速鑒定我們南部海區常見硨磲科物種無磷硨磲、鱗硨磲、長硨磲、諾瓦硨磲和硨蠔的試劑盒，其包括上述通用單引物和PCR反應試劑。

本發明的第三個目的是提供一種快速鑒定我們南部海區常見硨磲科物種無磷硨磲、鱗硨磲、長硨磲、諾瓦硨磲和硨蠔的鑒別方法，包括以下步驟：