[發明專利]人PIK3CA基因突變的數字PCR檢測方法及應用

在審

• 申請號: 202010670563.7
• 申請日: 2020-07-13
• 公開（公告）號: CN113930500A
• 公開（公告）日: 2022-01-14
• 發明（設計）人: 江螢;童慧娟;黃昕
• 申請（專利權）人: 銘熾生物科技（上海）有限公司;銘時醫療科技（寧波）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 徐迅;高一平

本發明提供了一種人PIK3CA基因突變的數字PCR檢測方法及應用。具體地，提供了優選的針對PIK3CA E545、E542和PIK3CA H1047所在序列的引物對、擴增方法、核酸探針以及檢測體系，進一步還提供了用于檢測PIK3CA基因突變的試劑盒。本發明通過優化的引物對和探針以及相應反應條件，從而可以對不同樣本高靈敏度、強特異性地檢測PIK3CA基因突變。

技術領域

本發明涉及基因檢測領域，具體地，涉及人PIK3CA基因突變的數字PCR檢測方法及應用。

背景技術

PIK3CA是位于3號染色體上的原癌基因，共有20個外顯子。PIK3CA突變約80％發生在螺旋區(Helical)和激酶區(Kinase)這兩個熱點區域，其中最常見的三個突變是外顯子20上的H1047R，外顯子9上的E542K和E545K。PIK3CA基因的突變不僅可以引起PI3Ks的催化活性增強，并且可促使細胞癌變。

PI3Ks作為EGFR下游信號分子被激活，可導致腫瘤細胞對EGFR-TKI藥物的耐藥，例如PIK3CA基因的突變可導致西妥昔單抗、帕尼單抗對轉移性結直腸癌治療的耐受，導致吉非替尼、厄洛替尼對非小細胞肺癌治療耐受。PIK3CA突變對于乳腺癌個體化靶向藥物曲妥珠單抗治療無效，野生型治療有效。KRAS、BRAF、PIK3CA任何一個或多個突變對結直腸癌個體化靶向藥物西妥昔單抗、帕尼單抗治療無效，全部為野生型治療有效。

因此，檢測PIK3CA基因突變可供醫生在非小細胞肺癌患者中選擇吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼等靶向藥物治療提供參考；在結直腸癌患者中使用西妥昔單抗和帕尼單抗等靶向藥物治療提供參考；以及在乳腺癌患者中選擇曲妥珠單抗等靶向藥物治療提供參考。

然而，在實際檢測結直腸癌患者的PIK3CA基因突變的過程中，仍然面臨著檢測樣本質量等問題。盡管腫瘤組織和腫瘤細胞學樣本是突變檢測的最佳樣本，但此類樣本獲取難度大。檢測血漿中的游離核酸(Circulating free DNA,簡稱“cfDNA”),又稱“液體活檢”，避免了需要腫瘤組織的活檢，在臨床上是一種非常有用的診斷應用。使用液體活檢提供了重復采血的可能性，從而允許在腫瘤發生過程中或者癌癥治療期間追蹤cfDNA的變化，進而監控病情變化。

然而，采用無細胞的核酸(如cfDNA)作為腫瘤患者中的生物標志物存在一定難度，尤其是應用cfDNA檢測準確并特異地檢測基因突變目前存在巨大的技術挑戰。首先，血液中的cfDNA含量因人而異，而且大部分情況都非常低,而其中腫瘤來源的游離核酸(Circulating tumor DNA,簡稱“ctDNA”)的質量更是參差不齊、含量高低不一。

不僅如此，cfDNA檢測方法特異性有待提高。Douillard等人報道，使用血漿檢測EGFR突變與腫瘤組織檢測結果的符合度僅為65％。

此外，目前雖然有一些基于cfDNA來檢測PIK3CA基因突變的方法，但是這些方法的靈敏度和特異性尚難以令人滿意。

因此，本領域迫切需要開發基于cfDNA的高靈敏度和高特異性檢測PIK3CA基因突變的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于cfDNA的高靈敏度和高特異性檢測PIK3CA基因突變的方法。

在本發明的第一方面，提供了一種用于檢測基因突變的試劑，所述試劑選自下組：

(a)用于檢測PIK3CA E545和/或E542突變的第一引物對，其中第一引物對包括SEQID No:1和2所示的引物；

(b)用于檢測PIK3CA H1047突變的第二引物對，其中第二引物對包括SEQ ID No:7和8所示的引物；

(c)上述(a)和(b)的組合。