[發(fā)明專利]多態(tài)SNP分子標記的篩選方法、多態(tài)SNP分子標記及引物對

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010655471.1
• 申請日: 2020-07-09
• 公開（公告）號: CN111676270B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發(fā)明（設計）人: 朱英;李裕冬;熊鐵一;鮮義坤
• 申請（專利權）人: 四川省自然資源科學研究院;峨眉山生物資源實驗站
• 主分類號: C12Q1/6809
• 分類號: C12Q1/6809;C12Q1/6888;C12N15/11;G16B20/20;G16B20/30;G16B15/00
• 代理公司: 成都立新致創(chuàng)知識產(chǎn)權代理事務所(特殊普通合伙) 51277
• 代理人: 陳丹丹

本發(fā)明涉及SNP分子標記技術領域，特別是涉及多態(tài)SNP分子標記的篩選方法，包括：通過對比重測序和參考基因組數(shù)據(jù)，獲得候選SNP位點；步驟二、競爭性等位基因特異性PCR擴增、熒光分型，確定具有多態(tài)的分型清晰的SNP分子標記。多態(tài)SNP分子標記及引物對包括第一SNP標記~第十九SNP標記中的至少一種。本發(fā)明解決多態(tài)SNP分子標記篩選過程中費時費力的問題。上述篩選方法得到的大熊貓通用的多態(tài)SNP分子標記，提供了19個有效的SNP分子標記，補充了大熊貓SNP分子標記的文庫。

技術領域

本發(fā)明涉及SNP分子標記技術領域，特別是涉及多態(tài)SNP分子標記的篩選方法、多態(tài)SNP分子標記及引物對。

背景技術

單核苷酸多態(tài)性(Single?Nucleotide?Polymorphism，SNP)廣泛存在動植物的基因組中，是單個核苷酸的變異導致的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的轉換、顛換、插入和缺失，是繼微衛(wèi)星標記之后的新一代分子標記。與微衛(wèi)星標記相比，SNP分布密度大，數(shù)量眾多，多態(tài)性豐富；突變率低，穩(wěn)定性和準確性高；不需檢測片段長度，只需檢測“有或無”確定多態(tài)性，從而易于實現(xiàn)自動化篩選。

SNP標記具有如下應用：1)可用于基因與疾病的關聯(lián)研究，定位疾病的靶基因；2)可用于動植物育種關鍵基因的篩選，通過比較不同表型的遺傳差異，篩選抗逆高產(chǎn)等關鍵SNP；3)可用于物種間進化關系的推算、物種內(nèi)親緣關系的鑒定，在醫(yī)學、農(nóng)學、林學方面，具有很好的應用潛力。

大熊貓是我國一級保護的珍稀瀕危野生動物，挖掘與大熊貓繁育性狀、疾病性狀等有關的SNP分子標記，是大熊貓遺傳管理工作的重要目標之一。雖然大熊貓的SNP位點數(shù)量眾多，但是只有具備在群體里擴增成功、分型成功且具有多態(tài)性的SNP位點才能成為有效的SNP分子標記。由此，開發(fā)一套適合大熊貓的簡便、經(jīng)濟、高效的SNP分子標記開發(fā)方法，可為大熊貓重要性狀的遺傳解析和功能驗證提供有力的工具。

在SNP群體驗證的方法中，傳統(tǒng)的做法通過設計引物、擴增后測定核苷酸序列，再通過觀察測序峰圖來判斷：1)測序結果是否清晰可用；2)SNP是否是多態(tài)；3)如果是多態(tài)再確定SNP的類型。由于需要對每一個個體測序結果逐一分析，不易實現(xiàn)SNP分型檢測的自動化，對于大規(guī)模群體的篩查，費時費力。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于以上所述現(xiàn)有技術的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種高通量多態(tài)SNP分子標記的篩選方法，用于解決現(xiàn)有技術中多態(tài)SNP分子標記篩選過程中費時費力的問題，同時，本發(fā)明還將提供一種大熊貓通用的多態(tài)SNP分子標記；此外，本發(fā)明還將提供一種用于大熊貓通用的多態(tài)SNP分子標記的引物對。

為實現(xiàn)上述目的及其他相關目的，

本發(fā)明的第一方面，提供一種高通量多態(tài)SNP分子標記的篩選方法，包括如下步驟

步驟一、通過對比重測序和參考基因組數(shù)據(jù)，獲得候選SNP位點；其中，所述候選SNP位點同時滿足如下條件：a、該區(qū)段中僅包含1個SNP位點，該SNP位點上下游100bp以內(nèi)沒有InDel標記和其他SNP位點；b、該SNP位點在所有個體中呈現(xiàn)多態(tài)性；c、該SNP質量＞1000；

步驟二、競爭性等位基因特異性PCR擴增、熒光分型，確定具有多態(tài)的分型清晰的SNP分子標記。

在第一步中，通過控制篩選條件(選擇SNP質量在1000以上且在群體呈現(xiàn)多態(tài)的SNP)，提高實際多態(tài)SNP標記的檢出概率。在第二步中，通過競爭性等位基因特異性PCR擴增、熒光分型，可根據(jù)KASP分型峰圖直接判斷該SNP位點是否為有效的SNP分子標記。如果所有個體分型結果圖呈現(xiàn)同色熒光，則表示該SNP位點為單態(tài)；如果所有個體分型結果圖呈現(xiàn)兩種及兩種以上熒光，則表示該SNP位點為雜合，則該SNP位點為有效的SNP分子標記。該篩選方法直觀明確，可以實現(xiàn)SNP分型檢測的自動化，便于大規(guī)模群體的篩選和檢測。該篩選方法不僅可用于大熊貓的SNP分子標記開發(fā)，也可以用于其他已知參考基因組序列的物種的SNP分子標記開發(fā)。