[發明專利]一株分泌雙甲脒單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用

在審

• 申請號: 202010650620.5
• 申請日: 2020-07-08
• 公開（公告）號: CN111763657A
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發明（設計）人: 胥傳來;晁夢佳;匡華;路倩倩;徐麗廣;劉麗強;宋珊珊;吳曉玲;胡擁明;鄭乾坤
• 申請（專利權）人: 江南大學;得利斯集團有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;C07K14/795;G01N33/577;G01N33/53
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

一種分泌雙甲脒單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，屬于食品安全免疫檢測領域。本發明分泌雙甲脒單克隆抗體的雜交瘤細胞株RC，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號CGMCC No.19166。利用該菌株分泌獲得的雙甲脒單克隆抗體用于進行食品安全檢測中雙甲脒殘留的分析檢測。本發明獲得的雙甲脒單克隆抗體細胞株RC可以用于免疫分析檢測，其對雙甲脒有較好的檢測靈敏度和特異性（IC₅₀值為0.3ng/mL、對雙甲脒類似物交叉小于10%，交叉率=（雙甲脒的IC₅₀/類似物的IC₅₀）×100%。

技術領域

本發明涉及一株分泌雙甲脒單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，屬于食品安全免疫檢測領域。

背景技術

雙甲脒又稱螨克，它是一種廣譜性甲脒類殺蟲殺螨劑，具有多種毒殺機制，主要用于果樹、蔬菜、茶葉、棉花、大豆等作物的除螨，對部分鱗翅目類害蟲卵有效，對害螨有觸殺及熏蒸作用，還可用于牛羊等牲畜防治蜱螨，由于雙甲脒可以有效防治狄瓦氏螨引起的蜂病，且對蜜蜂低毒，因此也廣泛用于蜂巢除螨。雙甲脒對人、畜中等毒性，對人的皮膚和粘膜有刺激性，對人體中樞神經系統能產生抑制作用，中毒后無特效藥物，其主要水解代謝產物2，4-二甲基苯胺具有高毒性，對人體有致癌、致突變等多種潛在危害。因此，澳大利亞、日本、韓國等國家和地區對食品中的雙甲脒殘留限量做了嚴格的規定。如歐盟、日本和美國規定蜂產品中雙甲脒限量為0.2 mg/kg；中國國家標準也規定了食品中雙甲脒的最大殘留限量：0.05～0.5 mg/kg。

對于雙甲脒農藥殘留的檢測，常采用高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相或液相色譜質譜聯用法。但這些方法存在樣品前處理復雜和檢測時間長等不足，不適用于大量樣品的快速檢測，為了維護廣大消費者的利益，有必要建立一種針對雙甲脒的高效、快速的檢測方法。酶聯免疫法(ELISA)是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時對樣本的前處理簡單、純化步驟少、分析容量大、檢測成本低而且操作簡便，適用于大量樣本的現場快速檢測，因此在農藥殘留分析中得到了廣泛應用。而使用酶聯免疫法檢測雙甲脒的前提是得到對雙甲脒具有高特異性和高靈敏度的單克隆抗體，因此，找到一種制備對雙甲脒具有高特異性和高靈敏度的單克隆抗體的方法十分關鍵。

發明內容

本發明的目的是克服上述不足之處，提供一株分泌雙甲脒單克隆抗體的雜交瘤細胞株RC及其應用。此雜交瘤細胞株分泌的雙甲脒單克隆抗體對雙甲脒具有較好的特異性和檢測靈敏度（IC₅₀值為0.3ng/mL），可以用于建立雙甲脒的免疫學檢測方法，檢測食品中雙甲脒的殘留。

本發明的技術方案：一株分泌雙甲脒單克隆抗體的雜交瘤細胞株RC，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，分類命名為單克隆細胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏編號CGMCC No.19166。

雙甲脒單克隆抗體，它由所述保藏編號為CGMCC No. 19166的雜交瘤細胞株RC分泌產生。

所述雙甲脒單克隆抗體的應用，將其應用于食品安全檢測中雙甲脒殘留的分析檢測。

本發明提供了上述一種分泌雙甲脒單克隆抗體的雜交瘤細胞株RC的制備方法，包含如下步驟：

（1）使用雙甲脒半抗原制備雙甲脒完全抗原，將獲得的雙甲脒完全抗原制備成含抗原弗氏佐劑與含抗原不完全弗氏佐劑；

（2）將得到的弗氏佐劑通過背部皮下注射，注射進入BALB/c小鼠體內進行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐劑，加強免疫采用不完全弗氏佐劑；

（3）將經過上述免疫過程的小鼠進行采血，通過間接ELISA檢測小鼠血清免疫效價和免疫抑制能力，篩選出血清中雙甲脒抗體含量高的獲得免疫的小鼠；