[發明專利]一種檢測硫氧還蛋白還原酶活性的方法

在審

• 申請號: 202010645541.5
• 申請日: 2020-07-06
• 公開（公告）號: CN111748604A
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 房建國;張軍民;李新明
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26;C07D339/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明的目的在于提供一種快速、簡便、經濟地檢測純硫氧還蛋白還原酶、細胞和體內組織中硫氧還蛋白還原酶活性的新方法。利用水溶性的硫氧還蛋白還原酶底物(TRS)分子4?氨基?1，2?二硫戊環類化合物，代替經典的硫氧還蛋白聯用胰島素終點法檢測硫氧還蛋白還原酶(TrxR)活性，本發明所述的TRS檢測TrxR活性的方法，具有很好的創新性性(首次發展的具有專一選擇性的TRS分子；首次將其應用于TrxR活性的檢測)、經濟環保性(降低原有方法的成本)，在體外純TrxR、細胞內TrxR和體內組織TrxR活性檢測方面具有很好的應用前景。

技術領域

本發明涉及化學醫藥領域，具體而言，涉及一種檢測硫氧還蛋白還原酶活性的方法。

背景技術

硫氧還蛋白系統由硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin Reductase,TrxR)、硫氧還蛋白(Thioredoxin,Trx)和NADPH組成。在生物體內TrxR從NADPH獲取電子，使其內源性底物Trx處于還原狀態，進而保證下游一系列氧化還原信號通路的正常運行(Trends PharmacolSci,2017,38:794-808.)。因此，Trx系統在調節生物體內氧化還原信號通路和維持正常的氧化還原水平中扮演非常重要的角色。

1977年人類首次從牛的組織中分離純化出TrxR，并且發現哺乳動物的TrxR可以催化機體的許多生化反應(J Biol Chem,1977,252(13):4600-6.)。Stadtman等人于1996年從人的T-細胞及肺癌細胞中分離純化出TrxR，并探知它是一種含硒的蛋白質(Proc NatlAcad Sci U S A,1996,93(3):1006-11.)。從此科學家對硫氧還原蛋白系統的研究也越來越熱并取得了一定成果。比如研究發現Trx系統與多種疾病如癌癥、糖尿病、神經退行性疾病和老年性高血壓等息息相關(Trends Pharmacol Sci,2017,38:794-808.)。TrxR和Trx的活性極有可能作為檢測這些疾病的生物標志，所以發展檢測TrxR活性的工具分子和方法很有臨床意義。

經典的檢測生物體內TrxR活性的方法是Trx聯用的胰島素(Insulin)終點法，該方法主要原理是，在待測樣品中，通過額外引用過量的NADPH、Trx和胰島素，使得TrxR還原Trx這一步成為整個循環反應的決速步驟。TrxR將Trx還原后，Trx進一步特異性將胰島素還原生成巰基。最后通過巰基檢測試劑DTNB滴定反應中生成的巰基量間接反應待測樣品中TrxR活性(Methods Enzymol,1999,300,226-239.)。盡管該方法在研究TrxR生物功能和靶向TrxR的藥物研發中得到廣泛的應用，但是在該方法中所使用的Trx和胰島素價格昂貴，在一定程度上限制了這一方法的應用。因此發展一種能快速、簡便且經濟的檢測TrxR活性的方法對TrxR的生物功能探究和靶向硫氧還蛋白系統的藥物研發至關重要。

發明內容

為解決上述問題，本發明所述的一種能快速、簡便且經濟的檢測TrxR活性方法的設計思路為：設計一種能夠快速且專一的識別TrxR的硫氧還蛋白還原酶底物(ThioredoxinReductase Substrate,TRS，圖1)分子，利用TrxR結構中暴露于蛋白表面的硒半胱氨酸(Sec)將TRS中二硫鍵還原成巰基，最后利用5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)滴定巰基，以反映體系中的TrxR活性。

為解決上述問題，本發明所述的一種檢測硫氧還蛋白還原酶活性的方法，具體步驟如下：

(1)基于以上設計思路，設計能夠識別TrxR的TRS類分子。

(2)TRS類分子對TrxR響應考察，以選擇理想的TRS。

(3)TRS類分子對TrxR專一性考察，以選擇理想的TRS。

(4)所選的TRS分子檢測TrxR活性的方法建立。

(5)TRS分子檢測TrxR活性方法的應用。