[發(fā)明專利]一種利用核酮糖單磷酸途徑和絲氨酸循環(huán)途徑協(xié)同同化甲醇的重構(gòu)甲基工程菌及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010644619.1
• 申請日: 2020-07-07
• 公開（公告）號: CN111808791A
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊松;陳文靜;袁肖杰;莫旭華;馬增新
• 申請（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P7/42;C12P7/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 瞿曉晶

本發(fā)明提供了一種利用核酮糖單磷酸途徑和絲氨酸循環(huán)途徑協(xié)同同化甲醇的重構(gòu)甲基工程菌及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域；所述重構(gòu)甲基工程菌的宿主菌包括天然利用絲氨酸循環(huán)途徑同化甲醇的甲基營養(yǎng)菌；所述重構(gòu)甲基工程菌中導(dǎo)入的外源基因包括己酮糖?6?磷酸合成酶的編碼基因和己酮糖?6?磷酸異構(gòu)酶的編碼基因。本發(fā)明以甲醇作為唯一碳源和能源且以天然利用絲氨酸循環(huán)途徑同化甲醇的甲基營養(yǎng)菌作為出發(fā)宿主，在出發(fā)宿主中引入異源表達(dá)編碼己酮糖?6?磷酸合成酶的基因hps和異源表達(dá)編碼己酮糖?6?磷酸異構(gòu)酶的基因phi，實(shí)現(xiàn)核酮糖單磷酸途徑的構(gòu)建，從而利用核酮糖單磷酸途徑和絲氨酸循環(huán)途徑協(xié)同同化甲醇。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用核酮糖單磷酸途徑和絲氨酸循環(huán)途徑協(xié)同同化甲醇的重構(gòu)甲基工程菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

甲基營養(yǎng)菌(Methylotrophs)是一類能夠以甲烷、甲醇、甲酸、甲銨等有機(jī)碳作為唯一碳源和能源生長的細(xì)菌。目前根據(jù)甲基營養(yǎng)菌同化代謝途徑不同，分為兩種主要類型，一種是利用核酮糖單磷酸途徑(Ribulose monophosphate pathway)同化有機(jī)碳一中間代謝物甲醛的甲基營養(yǎng)菌(如：Bacillus methanolicus MGA3，Methylobacillusflagellatus KT，Methylococcus capsulatus Bath)，同化過程生成的C6中間代謝物(如：果糖-6-磷酸)通過ED(Entner Doudoroff pathway)途徑和糖酵解途徑(Glycolysis，又稱EMP途徑)轉(zhuǎn)化成C3中間代謝物(如：丙酮酸)；另一種是利用絲氨酸循環(huán)途徑(Serinecycle)同化有機(jī)碳一中間代謝物甲酸的甲基營養(yǎng)菌(如：Methylorubrum extorquens AM1，Methylosinus trichosporium OB3b)，該同化過程可以合成C2中間代謝物乙酰輔酶A、C3中間代謝物(如：絲氨酸)和C4中間代謝物(如：蘋果酸)。近年針對利用絲氨酸循環(huán)同化有機(jī)碳(比如甲醇)的甲基營養(yǎng)菌模式菌M.extorquens進(jìn)行一系列代謝工程改造的研究，實(shí)現(xiàn)了催化甲醇轉(zhuǎn)化成2-羥基異丁酸、中康酸、(2S)-甲基琥珀酸、α-蛇麻烯、甲羥戊酸及3-羥基丙酸，但是在搖瓶產(chǎn)量普遍偏低，顯著低于以葡糖糖為碳源底物的傳統(tǒng)工業(yè)菌株(如：大腸桿菌、枯草芽胞桿菌和酵母菌)的產(chǎn)量。主要原因之一是絲氨酸循環(huán)同化甲酸過程中每生成1分子乙酰輔酶A消耗3分子NAD(P)H和3分子ATP，導(dǎo)致其能量轉(zhuǎn)化率低，并且甲酸徹底異化生成二氧化碳的過程會(huì)有大量碳外排，這就限制了目標(biāo)產(chǎn)品的生產(chǎn)能力。相比于絲氨酸循環(huán)同化途徑，核酮糖單磷酸途徑同化甲醛過程每合成1分子的丙酮酸僅消耗1分子ATP，并且產(chǎn)生3分子NAD(P)H。但是，進(jìn)一步生成乙酰輔酶A的過程，丙酮酸脫羧產(chǎn)生1分子二氧化碳，導(dǎo)致1/3碳量的丟失，而絲氨酸循環(huán)同化甲酸生成乙酰輔酶A的過程沒有碳丟失。目前，缺少一種能夠能夠高效同化甲醇的甲基營養(yǎng)菌。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用核酮糖單磷酸途徑和絲氨酸循環(huán)途徑協(xié)同同化甲醇的重構(gòu)甲基工程菌及其應(yīng)用，本發(fā)明的重構(gòu)甲基工程菌能夠利用核酮糖單磷酸途徑和絲氨酸循環(huán)途徑協(xié)同同化甲醇，能夠提高同化效率。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種利用核酮糖單磷酸途徑和絲氨酸循環(huán)途徑協(xié)同同化甲醇的重構(gòu)甲基工程菌，所述重構(gòu)甲基工程菌的宿主菌包括甲基桿菌Methylorubrum extorquensAM1、甲基桿菌Methylorubrum extorquens PA1或甲烷氧化菌Methylosinustrichosporium OB3b；所述重構(gòu)甲基工程菌中導(dǎo)入的外源基因包括己酮糖-6-磷酸合成酶的編碼基因和己酮糖-6-磷酸異構(gòu)酶的編碼基因。

優(yōu)選的，所述外源基因以質(zhì)粒作為載體導(dǎo)入所述宿主菌；所述己酮糖-6-磷酸合成酶的編碼基因和己酮糖-6-磷酸異構(gòu)酶的編碼基因串聯(lián)連接。