[發明專利]海洋源產PHA菌富集培養及接種、PCR擴增基因方法

在審

• 申請號: 202010640999.1
• 申請日: 2020-07-06
• 公開（公告）號: CN111849808A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 鄭維爽;黃藝;于盛洋
• 申請（專利權）人: 北京大學深圳研究院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12R1/07;C12R1/01
• 代理公司: 深圳市惠邦知識產權代理事務所 44271
• 代理人: 滿群

1.一種海洋源產聚羥基脂肪酸酯細菌富集培養基的配置方法，其特征在于，富集培養基使用鹽度和含油量梯度增加的基本培養基(minimal medium，MM培養基)，培養基的配置方法，包括以下步驟：

⑴富集培養基以MM培養基為基礎添加油和鹽，將1mL微量元素，溶解于1L的0.1mol/LHCl中；

⑵富集培養基中按照設定比例添加油類和氯化鈉(NaCl),所述MM培養基的含油量從1％開始，每個培養周期后提高0.5～1％含油量，含鹽量從陳海水鹽度從35‰開始，每個培養周期后，通過添加氯化鈉(NaCl)，鹽度提高為10‰；每個培養周期使用的梯度提高比例的MM培養基，以所在周期命名；

⑶調節培養基的pH值到7.4，在121℃下，高壓滅菌20min。

2.根據權利要求1所述海洋源產聚羥基脂肪酸酯細菌富集培養基的配置方法，其特征在于，步驟⑴所述MM培養基由以下質量分數wt％組成：

3.一種海洋源產聚羥基脂肪酸酯細菌富集的接種方法，其特征在于，包括以下步驟：

⑴以1:100的比例將海洋沉積物與MM1培養基混合，在搖床中充分搖晃培養一個周期，培養后的沉積物和培養基混合物稱為富集培養液；將當前MM1培養基中的富集培養液，以1:100的比例接種至下一個梯度的MM2培養基中，以此類推，完成6～8個周期的富集培養，所述一個周期為7～10天；

⑵每富集完成2～3個周期后，進行一次分離，得到形態、顏色均一的單菌落；

⑶通過菌落PCR擴增所述純化的單菌落的phaC合成酶基因，然后利用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，根據凝膠上是否有明顯的條帶判斷菌株是否產PHA，并利用PCR擴增16S rRNA基因，一代測序來鑒定菌株的分類地位。

4.根據權利要求3所述海洋源產聚羥基脂肪酸酯細菌富集的接種方法，其特征在于，步驟⑵所述的分離步驟進一步包括：

(2.1)快速搖動富集培養液30s使沉積物懸浮，然后取30μL懸浮液進行梯度稀釋，每個稀釋度涂布至2216E培養基表面，在30℃下培養2～7天；

(2.2)每天根據菌落的形態特征，利用三區劃線的方法純化菌落，直到得到顏色形態均一的單菌落。

5.根據權利要求3所述海洋源產聚羥基脂肪酸酯細菌富集的接種方法，其特征在于，步驟⑵所述分離出的菌落包括：通過所屬分離獲得厚壁菌門菌株11株，變形菌門菌株36株，其中21株菌株含有phaC合成酶基因，分離的潛在的產PHA菌株高達45％；獲得菌株來自11個屬，包括：尖球菌屬(Acuticoccus)、食烷菌屬(Alcanivorax)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、喜鹽芽孢桿菌(Halobacillus)、布倫茨氏菌屬(Labrenzia)、Maritimibacter菌屬、遠洋橄欖球形菌屬(Pelagibaca)、Ponticaulis菌屬、假單胞棲海洋菌屬(Pseudooceanicola)、Salipiger菌屬和Thalassospira菌屬。

6.一種利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增16Sr RNA基因序列鑒定菌株分類地位的方法，其特征在于，包括以下步驟：

⑴引物為：27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1472R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；

⑵PCR反應條件為首先在94℃下變性6min，然后在94℃下45s，54℃下30s，72℃下90s反應一個循環，共30個循環，最后在72℃下10min；

⑶利用NCBI的BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，確定與該序列最相似的模式菌株，初步判斷菌株的分類地位。

7.一種利用聚合酶鏈式反應(PCR)和瓊脂糖凝膠電泳鑒定菌株潛在合成PHA能力的方法，其特征在于，包括以下步驟：

⑴引物為：phaC1F1(5’-TGGARCTGATCCAGTAC-3’)和phaC1R1(5’-CGGGTTGAGRATGCTCTG-3’)；

⑵PCR反應條件：94℃下變性5min，然后以94℃下1min，54℃下1min，72℃下1min為一個反應循環，共反應30個循環，最后在72℃下延伸10min；

⑶PCR產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，使用1％瓊脂糖，電壓120V下分離15min分鐘，確定菌株有清晰的條帶，表征細菌具有phaC合成酶基因。