[發(fā)明專利]一種微流控細(xì)胞磁捕獲與檢測系統(tǒng)及其捕獲與檢測方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010639134.3
• 申請(qǐng)日: 2020-07-06
• 公開（公告）號(hào): CN111944656B
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬明;張宇;陳怡;顧寧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12M1/00
• 分類號(hào): C12M1/00;C12M1/34;C12Q1/06
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

本發(fā)明公開一種微流控細(xì)胞磁捕獲與檢測系統(tǒng)及其捕獲與檢測方法。將抗趨化因子受體CXCR4的抗體(12G5)、熒光分子Alexa Fluor 647(F647)修飾在磁性四氧化三鐵納米顆粒表面，構(gòu)建磁性熒光納米探針，并結(jié)合微流控芯片分選與磁捕獲，以及熒光定量分析儀進(jìn)行急性髓系白血病耐藥細(xì)胞的檢測。磁性熒光納米探針能特異性靶向急性髓系白血病耐藥細(xì)胞。將細(xì)胞與納米探針共孵育后，以一恒速通過所述微流控芯片，在微流控芯片一端的細(xì)胞捕獲區(qū)外加靜磁場，被磁標(biāo)記的細(xì)胞由于受到磁力作用滯留在微流控芯片的細(xì)胞捕獲區(qū)內(nèi)，而未被磁標(biāo)記的陰性細(xì)胞以及溶液中多余的納米探針會(huì)從微流控芯片的出口流出。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物與醫(yī)學(xué)納米材料及技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于磁性熒光納米探針結(jié)合微流控芯片與熒光定量分析儀實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的捕獲與檢測。

背景技術(shù)

急性髓系白血病(AML)是造血系統(tǒng)一種常見的惡性腫瘤，主要表現(xiàn)為髓系祖細(xì)胞不同程度的分化成熟障礙，白血病細(xì)胞的惡性增殖和凋亡受阻，正常造血功能的紊亂。據(jù)2019年美國癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，在所有類型的白血病中，急性髓系白血病(AML)患者新增人數(shù)與死亡人數(shù)均為第一，尤其是AML患者的死亡人數(shù)是其他類型白血病的2～10倍。目前AML誘導(dǎo)治療的標(biāo)準(zhǔn)是阿糖胞苷與蒽環(huán)類藥物(柔紅霉素等)等廣譜化療藥物聯(lián)合化療，容易發(fā)生耐藥與復(fù)發(fā)。目前AML完全緩解率為60％～80％，然而50％～70％患者仍會(huì)產(chǎn)生耐藥和復(fù)發(fā)，降低了AML生存期。急性髓系白血病的耐藥和復(fù)發(fā)是目前AML的治療瓶頸，因此解決AML耐藥性的問題對(duì)于降低其死亡率具有重大意義，其中的關(guān)鍵技術(shù)問題之一是AML耐藥細(xì)胞的捕獲與檢測。

趨化因子受體CXCR4可作為捕獲AML耐藥細(xì)胞的靶點(diǎn)。研究表明CXCR4與CXCL12生物軸是AML耐藥的重要機(jī)制。CXCL12結(jié)合并激活其在白血病細(xì)胞上的同源受體CXCR4，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞從血液循環(huán)遷移到骨髓，使得白血病細(xì)胞滯留在骨髓基質(zhì)微環(huán)境中，導(dǎo)致白血病細(xì)胞存活增加。同時(shí)白血病細(xì)胞與造血干細(xì)胞競爭相同的骨髓微環(huán)境，導(dǎo)致正常造血功能紊亂。此外，白血病細(xì)胞通過細(xì)胞表面表達(dá)的相應(yīng)受體(CD49d/VLA-4和CD44)與細(xì)胞外基質(zhì)分子(如纖連蛋白和透明質(zhì)酸)相互作用，不僅賦予細(xì)胞與骨髓微環(huán)境的黏附力，還通過激活下游信號(hào)通路，使得白血病細(xì)胞獲得耐藥和抗凋亡信號(hào)。臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示CXCR4高表達(dá)的患者總生存期和無病生存期更短，耐藥與復(fù)發(fā)的可能性更高。

目前主流的細(xì)胞分選方法主要有流式細(xì)胞分選和免疫磁珠細(xì)胞分選。流式細(xì)胞分選是用熒光染料標(biāo)記的抗體通過受體-配體相互作用標(biāo)記細(xì)胞，基于細(xì)胞的熒光和光散射特性實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選。雖然能獲得較高的分離細(xì)胞純度(大于90％)，但其儀器昂貴、操作技術(shù)難度高，而且通常需要超過10⁵個(gè)細(xì)胞作為起始上樣量。免疫磁珠細(xì)胞分選是在磁珠表面偶聯(lián)特異性抗體以標(biāo)記靶細(xì)胞，隨后通過施加磁場以分離磁標(biāo)記的細(xì)胞。然而免疫磁珠細(xì)胞分選通常需要配合高梯度磁性細(xì)胞分離柱使用，且其達(dá)到的強(qiáng)磁場可能會(huì)吸引本身有磁性的細(xì)胞聚集在分離柱中，導(dǎo)致細(xì)胞的非特異性捕獲。

因此，發(fā)明一種特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的細(xì)胞捕獲與檢測方法，克服目前細(xì)胞分選方法的局限性，能夠高效捕獲并定量出急性髓系白血病病人外周血中CXCR4陽性的耐藥細(xì)胞數(shù)量，對(duì)解決AML耐藥性問題、降低其死亡率具有重大意義，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題：本發(fā)明的目的是提供一種微流控細(xì)胞磁捕獲與檢測系統(tǒng)及其捕獲與檢測方法，針對(duì)目前急性髓系白血病的耐藥與復(fù)發(fā)現(xiàn)狀以及當(dāng)前細(xì)胞分選方法存在的局限，以磁性四氧化三鐵納米顆粒作為載體，設(shè)計(jì)一種磁性熒光納米探針，用于微流控實(shí)現(xiàn)細(xì)胞捕獲，并利用熒光定量分析儀實(shí)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量的定量檢測。

技術(shù)方案：本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明的一種微流控細(xì)胞磁捕獲與檢測系統(tǒng)，由磁性熒光納米探針、微流控芯片以及熒光定量分析儀三部分組成；所述磁性熒光納米探針是表面具有特異性識(shí)別趨化因子受體CXCR4的抗體12G5的四氧化三鐵納米顆粒，所述磁性熒光納米探針能夠特異性靶向樣本中的CXCR4陽性細(xì)胞；