[發明專利]一種利用鐵皮石斛發酵液制備水溶性多糖的方法

在審

• 申請號: 202010639033.6
• 申請日: 2020-07-06
• 公開（公告）號: CN111718428A
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發明（設計）人: 曹獻英;周鑫;王熙來;郭蘭
• 申請（專利權）人: 海南大學
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00;A61P29/00
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

1.一種利用鐵皮石斛發酵液制備水溶性多糖的方法，其特征在于，所述利用鐵皮石斛發酵液制備水溶性多糖的方法包括以下步驟：

步驟一，粗多糖的提取：將鐵皮石斛發酵液置于凍干機中凍干后，加入去離子水和乙醇，離心凍干得粗多糖；

步驟二，多糖脫蛋白：將得到的粗多糖溶解于去離子水中，加入Sevage試劑并劇烈振搖，靜置后離心、沉淀凍干，即得脫蛋白后的多糖；

步驟三，分離純化：稱取脫蛋白后的鐵皮石斛發酵多糖加入去離子水溶解，利用針頭過濾器進行過濾、洗脫，合并所有含糖組分，濃縮后凍干備用。

2.如權利要求1所述的利用鐵皮石斛發酵液制備水溶性多糖的方法，其特征在于，步驟一中，所述粗多糖的提取方法具體包括：

(1)取鐵皮石斛發酵液放在培養皿中，置于凍干機中凍干48小時；

(2)在凍干的發酵液中加入去離子水并放在90℃的水浴中加熱使其溶解，溶解完全后加入3倍量的95％乙醇，得到絮狀沉淀；

(3)將步驟(2)得到的絮狀沉淀在離心機中離心，去除多余的上清液；

(4)將絮狀沉淀放在凍干機中凍干48小時得到粗多糖。

3.如權利要求2所述的利用鐵皮石斛發酵液制備水溶性多糖的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述鐵皮石斛發酵液是由5％的鐵皮石斛原莖發酵而成。

4.如權利要求2所述的利用鐵皮石斛發酵液制備水溶性多糖的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述離心速度為1500r/min，離心時長20min。

5.如權利要求1所述的利用鐵皮石斛發酵液制備水溶性多糖的方法，其特征在于，步驟二中，所述多糖脫蛋白的方法具體包括：

(1)將步驟一得到的粗多糖中加入適量的去離子水后利用超聲或水浴加熱促進溶解；加入Sevage試劑(V_氯仿：V_正丁醇＝4：1)，按多糖溶液和Sevage試劑以3：1的體積混合劇烈振搖30分鐘；

(2)靜置3小時后，置于離心機中離心，分出在有機層和水層之間的沉淀；分液后，有機層回收，水液中繼續加入3倍量的95％乙醇得到沉淀；

(3)將(2)得到的沉淀繼續凍干得到脫蛋白后的多糖；利用苯酚硫酸法測定多糖的含量。

6.如權利要求5所述的利用鐵皮石斛發酵液制備水溶性多糖的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述離子水的量為多糖體積的20-30倍；促進溶解的方法為超聲波機中室溫60％的功率超聲30分鐘，或者放在水浴鍋中90℃加熱。

7.如權利要求5所述利用鐵皮石斛發酵液制備水溶性多糖的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述離心轉速為5000r/min，離心時長為10分鐘。

8.如權利要求1所述的利用鐵皮石斛發酵液制備水溶性多糖的方法，其特征在于，步驟三中，所述分離純化的方法具體包括：

1)稱取脫蛋白后的鐵皮石斛發酵多糖，并加入適量的去離子水將其完全溶解，用孔徑0.22μL直徑1.2cm的針頭過濾器進行過濾；

2)將濾液DEAE-52陰離子交換柱層析脫色和初分；

3)合并所有含糖組分，濃縮后凍干；

4)稱取經脫色后的多糖，以適量去離子水溶解后，用孔徑用孔徑0.22μL直徑1.2cm的針頭過濾器進行過濾；

5)將步驟4)得到的濾液用SephadexG-100凝膠色譜柱作進一步純化；以苯酚-硫酸法顯色；

6)合并所有含糖組分，濃縮凍干后備用；

7)凝膠滲透色譜GPC測定分子量，得到單一對稱峰證明樣品為純多糖。

9.如權利要求8所述的利用鐵皮石斛發酵液制備水溶性多糖的方法，其特征在于，步驟2)中，用去離子水和0.1-0.8mol/L的氯化鈉溶液作為洗脫機進行梯度洗脫，等量接收。

10.如權利要求8所述的利用鐵皮石斛發酵液制備水溶性多糖的方法，其特征在于，步驟4)中，用去離子水作為洗脫液，流速為0.6ml/min，以3.0ml/管等量接收。