[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)單鼠李糖脂的基因改造方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010638123.3
• 申請(qǐng)日: 2020-07-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111849846A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙峰;董梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 曲阜師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/78;C12N15/66;C12N15/90;C12P19/44;G01N30/02;G01N30/72;C12R1/385
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

1.一種高產(chǎn)單鼠李糖脂的基因改造方法，其特征在于該方法是以銅綠假單胞菌為出發(fā)菌株，以催化單鼠李糖脂合成雙鼠李糖脂的鼠李糖脂合成酶Ⅱ（RhlC）的編碼基因rhlC為改造目標(biāo)，且按如下步驟進(jìn)行：

1）根據(jù)銅綠假單胞菌的rhlC基因序列設(shè)計(jì)PCR引物；所設(shè)計(jì)的銅綠假單胞菌的rhlC基因的PCR引物為C-f：5'-CCGAAGCTTATGAGCGGCCTGTTCCACT-3'，C-r: 5'-CTTGGAATTCCCGGAAGCTACGGACG-3'，上下游引物中分別引入在rhlC基因序列中沒(méi)有、且在pK18mobSacB的多克隆位點(diǎn)（MCS）中含有的酶切位點(diǎn)（引物中劃線部分），Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ；

2）以銅綠假單胞菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增rhlC基因，克隆到pMD系列載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-rhlC；

3）根據(jù)rhlC基因序列內(nèi)部特有的酶切位點(diǎn)，酶切rhlC基因序列內(nèi)部，純化自連，構(gòu)建rhlC基因內(nèi)部序列缺失的新質(zhì)粒pMD-?rhlC；

4）通過(guò)雙酶切方法將?rhlC片段插入到質(zhì)粒pK18mobSacB中構(gòu)建打靶質(zhì)粒pK18-?rhlC；

5）打把質(zhì)粒pK18-?rhlC導(dǎo)入到銅綠假單胞菌內(nèi)，在篩選壓力作用下，質(zhì)粒pK18-?rhlC與銅綠假單胞菌染色體基因發(fā)生二次同源重組，獲得敲除rhlC基因的銅綠假單胞菌敲除菌株；

6）銅綠假單胞菌敲除菌株發(fā)酵生產(chǎn)驗(yàn)證，利用HPLC-MS方法驗(yàn)證單鼠李糖脂產(chǎn)物，利用排油圈法測(cè)定單鼠李糖脂產(chǎn)量。

2.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟2）：PCR擴(kuò)增rhlC基因的反應(yīng)體系：10×PCR Buffer2.5μL，2.5mM 的dNTP Mixture 2μL，10Μm的C-f和C-r引物各0.8μL，Extaq Polymerase0.125μL，銅綠假單胞菌基因組DNA 1μL，補(bǔ)充PCR水至總體系25μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，35個(gè)循環(huán)：94℃變性1min、56℃退火30s、72℃延伸1min30s，72℃ 10min；PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳、試劑盒切膠純化后， rhlC基因片段與pMD系列（18/19/20）T simple載體進(jìn)行AT連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-rhlC。

3.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟3）：利用限制性內(nèi)切酶Sal Ⅰ試劑盒酶切質(zhì)粒pMD-rhlC的rhlC基因內(nèi)部序列，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳、試劑盒切膠純化后，自連，得到rhlC基因內(nèi)部缺失400~500bp序列的新質(zhì)粒pMD-?rhlC。

4.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟4）：利用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ試劑盒，雙酶切質(zhì)粒pMD-?rhlC和銅綠假單胞菌的自殺性質(zhì)粒pK18mobSacB，?rhlC片段和pK18mobSacB質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳、試劑盒切膠純化后，連接，構(gòu)建打靶質(zhì)粒pK18-?rhlC。

5.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟5）：打把質(zhì)粒pK18-?rhlC先轉(zhuǎn)化到大腸桿菌S17-1感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建重組大腸桿菌 S17-1 (pK18-?rhlC)，再通過(guò)接合轉(zhuǎn)移方法將質(zhì)粒pK18-?rhlC導(dǎo)入到銅綠假單胞菌內(nèi)；在氨芐青霉素、卡那霉素和蔗糖的篩選壓力作用下質(zhì)粒pK18-?rhlC與銅綠假單胞菌染色體rhlC基因的同源序列發(fā)生二次同源重組，缺失內(nèi)部序列的?rhlC基因片段替換掉染色體上的rhlC基因，篩選獲得rhlC基因被破壞的銅綠假單胞菌敲除菌株。