[發明專利]一種用于檢測大白菜根腫病抗性基因CRs的生物材料及其應用

有效

• 申請號: 202010637050.6
• 申請日: 2020-07-03
• 公開（公告）號: CN111808853B
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發明（設計）人: 原玉香;楊雙娟;趙艷艷;張曉偉;魏小春;王志勇;趙肖斌;牛劉靜;李林;王坐京
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院園藝研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6895;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 王灝增

本發明涉及一種用于檢測大白菜根腫病抗性基因CRs的生物材料及其應用。本發明利用CRs緊密連鎖的HRM標記Probe55的引物進行PCR擴增和測序，發現了1個新的InDel位點為43bp處11bp的InDel變異，設計開發了KASP標記CRs?KASP1，該標記可以高通量檢測根腫病抗病基因CRs的基因型，整個檢測過程只需要進行一次PCR，然后借助軟件即可清楚的辨別每個樣品的基因型，能夠高效率、低成本應于大白菜根腫病抗性新品種的分子標記輔助育種，具有非常重要的意義。

技術領域

本發明涉及作物分子標記輔助育種技術領域，具體涉及一種用于檢測大白菜根腫病抗性基因的高通量檢測標記及其應用。

背景技術

根腫病也稱“根癌”，是由蕓薹根腫菌(Plasmodiophora brassicae Woron.)侵染引起的世界性土傳病害，主要侵染大白菜、小白菜、甘藍、蘿卜、花椰菜、芥菜、油菜等十字花科植物。根腫菌侵染后會導致根部細胞異常增殖，形成腫瘤，從而影響水分和營養物質的運輸，造成植株地上部分缺乏養分枯萎，直至全株死亡。利用抗根腫病基因培育抗病品種具有安全、高效、經濟的特點，是從根本上解決根腫病困擾的重要途徑之一，而通過尋找與抗根腫病基因緊密連鎖的分子標記，利用分子標記輔助選擇育種(marker-assistedselection)能夠大大提高抗病育種效率。

Laila等(2019)通過ddRAD-seq(double digest restriction site-associatedDNA sequencing，雙酶切位點DNA測序)方法在白菜A08染色體上檢測到一個新的根腫病抗性位點CRs，位于7.9-11.9Mb區間，進一步開發了HRM(High resolution melting，高分辨率溶解曲線)標記，將抗病基因CRs定位于10.75-11.5Mb區間(Laila et al.,2019.Mappingof a novel clubroot resistance QTL using ddRAD-seq in Chinese cabbage(Brassica rapa L.).BMC Plant Biology,19:13)。其中Probe55為CRs緊密連鎖的HRM標記，該標記使用HRM非標記探針法對大白菜A08染色體9,956,858bp(大白菜參考基因組version1.5)處的SNP位點進行基因型鑒定。但是HRM非標記探針法的缺點是需要設計包含變異位點的20-35bp的核苷酸單鏈作為探針，并在3’端加入磷酸基團、氨基等封閉探針的3’端，所以引物合成費用比較高(豐貴鵬和李亮，高分辨率熔解曲線法的非標記探針基因分型技術，生命的化學，2010，30(2)：314-317)。此外，HRM標記受樣品基因組提取方法、樣品模板特異性、PCR反應模板濃度和熔解設備自身溫差多種因素影響，需要PCR反應體系的所有DNA濃度進行檢測，并保證濃度要均一，這些因素均限制了HRM標記的廣泛應用(劉自增等，高分辨率熔解曲線分析應用的研究進展，中國畜牧獸醫，2013,40(8)：105-111)。競爭性等位基因特異性PCR(Kompetitive allele specific PCR，KASP)是由英國LGC公司開發的新一代高通量自動化SNP(Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態性)的檢測技術，現已成為國際上SNP和InDel(Insertion or Deletion，插入缺失變異)基因分型分析的主流方法之一。KASP反應體系包括：(1)帶有兩種通用標簽并連接SNP位點的兩條正向引物和一條反向引物構成的Primer mix；(2)帶有不同熒光信號的兩條檢測引物Master mix；(3)DNA模板。同其他檢測技術相比，KASP技術只需在兩條正向引物5’端分別添加兩個通用探針，這兩個探針分別為Master mix中攜帶FAM和HEX兩種熒光基團的核苷酸序列，不需要進行磷酸化等特異修飾，不需要針對每個SNP位點分別設計熒光探針，具有高通量、準確、省時、便捷、低成本的特點，實現了更加靈活的檢測(王富強等，SNP分子標記在作物品種鑒定中的應用和展望，植物遺傳資源學報，2020：1-20)。

發明內容