[發(fā)明專利]一種基于RAA-LFD檢測新冠病毒的方法

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• 申請日: 2020-07-03
• 公開（公告）號: CN111676324A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發(fā)明（設計）人: 林敏;鄭玉忠;楊培奎;林麗云;陳江濤;吳顯勁
• 申請（專利權）人: 韓山師范學院;惠州市中心人民醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844
• 代理公司: 北京勁創(chuàng)知識產權代理事務所(普通合伙) 11589
• 代理人: 徐家升

本發(fā)明公開了一種基于RAA?LFD檢測新冠病毒的方法，包括如下步驟：樣本留取；核酸提取；標準質粒構建；以新冠病毒COVID?19 N基因作為靶基因，分析新冠病毒COVID?19 N基因的序列特點；使用RAA核酸擴增試劑盒進行RAA反應體系的配制；RAA反應結束后，打開Eppendorf管，吸取擴增產物至一新的Eppendorf管中，做好標記，并稀釋50倍，馬上進行試紙條檢測；利用試劑盒進行RAA擴增和試紙條檢測，獲得產品的檢測下限為1×10¹拷貝/μL；以超純水作為陰性對照，以1×10⁰拷貝/μL、1×10¹拷貝/μL、1×10²拷貝/μL、重組質粒為模板，進行3次平行試驗。本發(fā)明檢測靈敏度高，操作簡便快速，無需專門設備，結果準確可以滿足臨床樣本的檢測，特別適合資源匱乏地區(qū)或機場、學校等單位的流動應急檢測。

技術領域

本發(fā)明涉及新冠病毒檢測技術領域，特別涉及一種基于RAA-LFD檢測新 冠病毒的方法。

背景技術

新型冠狀病毒-嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(Severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是一種先前未在人類中發(fā)現(xiàn)的病原體， 能在人與人之間迅速傳播。COVID-19尚無有效治療藥物，目前的手段主要是 隔離治療和對癥支持。因此加強COVID-19實驗室病原學快速檢測則是 COVID-19有效監(jiān)測和診斷的關鍵。

核酸檢測技術是最直接、最本質的病原學證據(jù)，是確診SARS-CoV-2感 染的“金標準”，優(yōu)于其他臨床表現(xiàn)、臨床體征及CT檢測等經驗判讀。目前 用于檢測SARS-CoV-2的常規(guī)方法是采用實時熒光RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)，該方法能夠從鼻腔或咽拭子、痰液 或支氣管肺泡灌洗液中檢測SARS-CoV-2。然而，實時熒光RT-qPCR成本高 昂，花費昂貴(3-4h)，需要大量的實驗室基礎設施和培訓，妨礙了它們在資源有限的領域中的使用(例如在醫(yī)療設施落后地區(qū)或者港口、機場或車站等 人流密集的防控一線的快速檢測)。此外，長時間的過程增加了SARS-CoV-2 進一步傳播的風險，并阻礙了對所有潛在接觸的廣泛檢測；高通量測序技術 (High-throughput sequencing)又稱“下一代”測序技術(Next-generation sequencing technology,NGS)，是對包括新冠病毒在內的所有病原體以及病原 體的全基因序列進行完整測序，并與已知病毒序列進行全序列比對分析來診 斷SARS-CoV-2是否存在。盡管NGS具有很多優(yōu)勢，包括可以對病毒進化來 源、致病病理機制和病毒變異情況進行研究與分析，但NGS技術的自身限制 (耗時更長、需要昂貴的二代測序設備和嚴格的操作環(huán)境)，注定了高通量 測序技術也只能作為實時熒光RT-PCR的補充，更不適合作為一項應急的快速 篩查方法。因此，無論是上述的那種方法，均不適合在條件相對貧乏的地區(qū) 或單位進行即時檢驗(point-of-care testing，POCT)。