[發(fā)明專利]一種海水養(yǎng)殖尾水微生物凈化制劑、其制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010636942.4
• 申請(qǐng)日: 2020-07-03
• 公開（公告）號(hào): CN111748509B
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 傅玲琳;王彥波;王飛飛;周瑾茹;周志剛;劉長(zhǎng)軍;伊祥華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工商大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N1/20;C12N1/04;C12N15/78;C12N15/31;C02F3/34;C12R1/40;C12R1/38;C02F103/20
• 代理公司: 杭州創(chuàng)造力專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33332
• 代理人: 陳沖

1.一種海水養(yǎng)殖尾水生物膜微生物凈化制劑的制備方法，其特征在于：所述生物膜微生物凈化制劑的功能微生物由門多薩假單胞菌和施氏假單胞菌、ppuI基因過(guò)表達(dá)惡臭假單胞菌組成，還包括以下制備步驟，

制備混合菌液；

利用所述混合菌液制備混合菌體凍干粉；

其中所述混合菌液的制備包括門多薩假單胞菌培養(yǎng)液1~2份和施氏假單胞菌培養(yǎng)液1~2份、將ppuI基因過(guò)表達(dá)惡臭假單胞菌培養(yǎng)液2~3份復(fù)合調(diào)配；以及所述ppuI基因過(guò)表達(dá)惡臭假單胞菌還包括以下構(gòu)建步驟：

提取惡臭假單胞菌基因組DNA；

以提取的基因組DNA為模板、以ppuI-F和ppuI-R為引物，對(duì)ppuI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

所述ppuI基因的PCR電泳條帶經(jīng)回收后，與經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切的載體pBBR1MCS-2連接，獲得重組質(zhì)粒；

將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliSM10感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；

利用接合轉(zhuǎn)移將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至惡臭假單胞菌，經(jīng)篩選及驗(yàn)證，得到所述ppuI基因過(guò)表達(dá)惡臭假單胞菌。

2.如權(quán)利要求1所述的海水養(yǎng)殖尾水生物膜微生物凈化制劑的制備方法，其特征在于：所述混合菌液的制備包括，

設(shè)定所選菌體培養(yǎng)液的細(xì)菌濃度為4~8×10⁸CFU/mL。

3.如權(quán)利要求1或2所述的海水養(yǎng)殖尾水生物膜微生物凈化制劑的制備方法，其特征在于：所述混合菌體凍干粉的制備包括以下步驟，

將所述混合菌液在轉(zhuǎn)速為8000-10000r/min的條件下離心10min；

得到菌泥均勻分散于10mL、0.1-0.5mol/L的甘露醇和葡萄糖復(fù)配保護(hù)劑溶液中制成菌懸液；

將所述菌懸液于4℃預(yù)冷40min，投入液氮中預(yù)凍2h后，轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)中，進(jìn)行真空干燥，得到混合菌體凍干粉；

所述混合菌體凍干粉置于4℃冰箱密封保存。

4.如權(quán)利要求1所述的海水養(yǎng)殖尾水生物膜微生物凈化制劑的制備方法，其特征在于：所述ppuI基因過(guò)表達(dá)惡臭假單胞菌株包括，

隨著細(xì)胞密度增加，能合成大量3-oxo-C10和3-oxo-C12信號(hào)分子。

5.如權(quán)利要求1所述的海水養(yǎng)殖尾水生物膜微生物凈化制劑的制備方法，其特征在于：所述ppuI-F的序列如下，

CGCTCTAGAACTAGTGGATCCATGCTTATCTCCATTGATCGCCGC。

6.如權(quán)利要求1所述的海水養(yǎng)殖尾水生物膜微生物凈化制劑的制備方法，其特征在于：所述ppuI-R的序列如下，

GTCGACGGTATCGATAAGCTTTCAATGGCAGTTATTCTTGATGG。

7.一種海水養(yǎng)殖尾水生物膜微生物凈化制劑的應(yīng)用，其特征在于：包括如權(quán)利要求1~6任一所述的生物膜微生物凈化制劑，還包括以下應(yīng)用步驟，

活化：將制成的混合菌體凍干粉復(fù)溶于無(wú)菌生理鹽水中制成菌懸液，移植于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，刮取菌苔進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至濃度大于3×10⁸CFU/mL，得到微生物凈化制劑；

投加：將活化后的微生物凈化制劑直接均勻投加到海水養(yǎng)殖生物濾池中。

8.如權(quán)利要求7所述的海水養(yǎng)殖尾水生物膜微生物凈化制劑的應(yīng)用，其特征在于：包括以下步驟，

活化：將制成的混合菌體凍干粉復(fù)溶于無(wú)菌生理鹽水中，制成菌懸液，移植于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，刮取菌苔進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至濃度大于3×10⁸CFU/mL，得到微生物凈化制劑；

噴灑：將活化后的微生物凈化制劑裝入噴淋器，均勻噴灑到附著基上作為其他生物膜微生物的生物強(qiáng)化劑，置于海水養(yǎng)殖生物濾池下方進(jìn)行掛膜強(qiáng)化培養(yǎng)。