[發明專利]一種基于環境DNA的過魚通道效果監測和評估方法

在審

• 申請號: 202010635787.4
• 申請日: 2020-07-03
• 公開（公告）號: CN111690725A
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發明（設計）人: 朱書禮;李新輝;李捷;李躍飛;陳蔚濤;楊計平;武智
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6888;G16B25/20;G16B30/10
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 李枝玲

1.一種基于環境DNA的過魚通道效果監測和評估方法，其特征在于：包括如下步驟：

S1、在過魚通道的入口、出口和休息池設置3個采樣點，采集水樣并保存；

S2、將采集的水樣進行抽濾，然后提取總的環境DNA；

S3、以提取的總的環境DNA為模板，利用設計的引物進行PCR擴增16S rDNA序列，獲得PCR產物；

S4、將PCR產物回收、純化，進行高通量測序，獲得PCR產物序列；

S5、建立魚類16S rDNA序列比對數據庫；

S6、通過BLAST在NCBI數據庫和已構建的數據庫查找同源序列，確定魚類物種信息；

S7、統計所獲得的魚類物種信息，完成過魚通道效果的監測和評估。

2.根據權利要求1所述的一種基于環境DNA的過魚通道效果監測和評估方法，其特征在于，所述S1中采集水樣分別在表層、中層和下層各采集3次水樣，每次采集2L水樣，樣品保存要置于4℃冷藏，并在24h內進行抽濾處理。

3.根據權利要求1所述的一種基于環境DNA的過魚通道效果監測和評估方法，其特征在于，所述S2中水樣抽濾使用的濾膜規格為0.45μm孔徑的硝酸纖維素無菌過濾膜，樣品抽濾后直接提取DNA或者置于-20℃保存，總的環境DNA的提取采用氯仿萃取法提取或使用DNA提取試劑盒。

4.根據權利要求1所述的一種基于環境DNA的過魚通道效果監測和評估方法，其特征在于，所述S3中各采樣點采集的表層、中層和下層水樣抽濾后混合作為該采樣點樣本進行總環境DNA提取。

5.根據權利要求1所述的一種基于環境DNA的過魚通道效果監測和評估方法，其特征在于，所述S3中PCR擴增使用的引物為：

正向引物F：5-GCCTGTTTACCAAAAACATCAC-3；

反向引物R：5-CCGGTCTGAACTCAGAT CACGT-3；

目標片段長度為546bp。

6.根據權利要求5所述的一種基于環境DNA的過魚通道效果監測和評估方法，其特征在于，所述S3中PCR擴增使用25μL反應體系：

2.5μL 10×buffer，2μL dNTP，各1μL正反引物，0.15μL Taq酶，1μL DNA模板，17.35μLddH2O；

反應條件設置為：94℃預變性2min；

94℃變性30s，50℃退火40s，72℃延伸1min，35個循環；

72℃延伸10min。

7.根據權利要求1所述的一種基于環境DNA的過魚通道效果監測和評估方法，其特征在于，所述S5中根據過魚通道所在水域的魚類歷史調查資料和文獻資料，掌握水域魚類種類信息；在NCBI數據庫查詢搜集魚類16S rDNA序列，并用權利要求4所述引物PCR擴增，補充未查詢到的序列，構建序列比對數據庫。