[發(fā)明專利]一種快周期油菜在油菜功能基因研究領域的應用及方法

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• 申請日: 2020-07-02
• 公開（公告）號: CN111778275A
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發(fā)明（設計）人: 楊梅;楊銘浩;鄧揚菲;楊峻輝;孟冬林;楊峻燁;莫從古;許興旺;錢匯海
• 申請（專利權）人: 珠海市農騰樂油植物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/20;A01H1/02;A01H1/04;A01H1/06
• 代理公司: 北京安度修典專利代理事務所(特殊普通合伙) 11424
• 代理人: 楊方成

1.一種快周期油菜在油菜功能基因組學研究領域的應用，其特征在于：

所述快周期油菜為完成一個生命周期很短的一種甘藍型油菜(Brassica napus)，其在22℃、16小時光/8小時暗培養(yǎng)條件下，從出苗到成熟周期僅約60天；

所述功能基因研究包括基因編輯和/或基因突變體的制備。

2.一種基于快周期油菜進行油菜基因編輯的方法，其特征在于，所述方法采用所述快周期油菜作為供體進行目標基因的編輯，外植體接種后80天左右即可收獲基因編輯子代，具體包括如下步驟

(1)取所述快周期油菜的種子進行表面消毒后播種，制備得到外植體，備用；

(2)根據目標基因的序列結構，構建基因編輯載體，并轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞；

(3)將得到的大腸桿菌感受態(tài)細胞與農桿菌電擊融合后，以所得農桿菌液浸染步驟(1)中獲得的外植體；

(4)將浸染過所述農桿菌液的外植體轉到M1培養(yǎng)基中，置于22℃暗室進行共培養(yǎng)36-48h；

(5)將步驟(4)培養(yǎng)后的外植體從M1培養(yǎng)基轉移到M2培養(yǎng)基中，并于22℃進行光照培養(yǎng)2周；

(6)將培養(yǎng)后的外植體轉入到M3培養(yǎng)基中，經常規(guī)培養(yǎng)形成小苗；

(7)對選定的編輯位點進行測序，確定為陽性單株的小苗移栽到溫室進行培養(yǎng)，成活后按常規(guī)苗管理，即得。

3.根據權利要求2所述基于快周期油菜進行基因編輯的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，所述M1培養(yǎng)基包括如下含量的成分：MS成品粉末4.4g，蔗糖30g，D-甘露糖醇18g，2,4-二氯苯氧乙酸1mg，激動素0.3mg，Phytagel 5.5g，ddH₂O定容至1L，調節(jié)pH值5.88；高溫滅菌后加入乙酰丁香酮100μmol，混合均勻。

4.根據權利要求2或3所述基于快周期油菜進行油菜基因編輯的方法，其特征在于，所述步驟(5)中，所述M2培養(yǎng)基包括如下含量的成分：MS成品粉末4.4g，蔗糖30g，D-甘露糖醇18g，2,4-二氯苯氧乙酸1mg，激動素0.3mg，Phytagel 5.5g，ddH₂O定容至1L，調節(jié)pH值5.86；高溫滅菌后加入硫代硫酸銀150μl及特美汀300mg，硫酸卡那霉素25mg。

5.根據權利要求4所述基于快周期油菜進行基因編輯的方法，其特征在于，所述步驟(5)中，所述光照培養(yǎng)中，控制光照條件為16小時光照/8小時黑暗。

6.根據權利要求2-5任一項所述基于快周期油菜進行基因編輯的方法，其特征在于，所述步驟(6)中，所述M3培養(yǎng)基包括如下含量的成分：MS成品粉末4.4g，蔗糖30g，Phytagel5.5g，ddH₂O定容至1L，調節(jié)pH值5.84-5.88；高溫滅菌后加入特美汀300mg。

7.根據權利要求2-6任一項所述基于快周期油菜進行基因編輯的方法，其特征在于，所述步驟(7)中，所述培育步驟的培養(yǎng)條件為22℃、16小時光/8小時暗。

8.一種基于快周期油菜制備功能基因突變體的方法，其特征在于，所述方法采用所述快周期油菜作為供體，進行誘變處理，具體包括如下步驟：

(1)取所述快周期油菜的種子M0進行浸水吸脹預處理，備用；

(2)將所述快周期油菜進行誘變處理，獲得快周期M1種子，備用；

(3)將所得快周期M1種子播種于培養(yǎng)間，篩選突變表型自交獲得快周期M2種子，備用；

(4)將所述快周期M2種子繼續(xù)播種于培養(yǎng)間，驗證其突變表型是否可遺傳，并收集突變株繼續(xù)自交，獲得M3突變株；

(5)取所述M3突變株種成家系，無分離的突變株系繼續(xù)自交，即可獲得純合的M4突變體。

9.根據權利要求8所述基于快周期油菜制備功能基因突變體的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述誘變步驟包括化學誘變和/或物理誘變。

10.根據權利要求8所述基于快周期油菜制備油菜基因突變體的方法，其特征在于，所述步驟(3)、(4)、(5)中，控制培養(yǎng)條件為：溫度22℃，光照16小時光/8小時暗。