[發(fā)明專利]一種ddPCR檢測肝癌預(yù)后標(biāo)志物TP53 R249S的引物探針組、試劑盒和方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010631194.0
• 申請日: 2020-07-03
• 公開（公告）號: CN111705132A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔣德科;諶婷
• 申請（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市科豐知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44467
• 代理人: 龔元元

1.一種ddPCR檢測肝癌預(yù)后標(biāo)志物TP53 R249S的引物探針組，其特征在于，所述引物探針組的核苷酸序列如下所示：

TP53-F GTACCACCATCCACTACAACTACATGT(SEQ ID NO:2)

TP53-R GGCTCCTGACCTGGAGTCTTC(SEQ ID NO:3)

TaqMan MGB(WT)FAM-ACCGGAGTCCCATC-MGB(SEQ ID NO:4)

TaqMan MGB(MT)VIC-ACCGGAGGCCCAT-MGB(SEQ ID NO:5)。

2.一種ddPCR檢測肝癌預(yù)后標(biāo)志物TP53 R249S的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求1所述的引物探針組。

3.一種利用權(quán)利要求1所述的引物探針組檢測肝癌預(yù)后標(biāo)志物TP53 R249S的ddPCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取待測樣品DNA；

(2)配置ddPCR反應(yīng)體系；

(3)將步驟(2)中的ddPCR體系置于微滴生成儀中進(jìn)行微滴生成；

(4)將步驟(3)中生成的微滴進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(5)將步驟(4)中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行微滴讀數(shù)，判斷是否為陽性微滴。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測肝癌預(yù)后標(biāo)志物TP53 R249S的ddPCR檢測方法，其特征在于，所述提取待測樣品DNA是指采用QIAamp Blood Mini Kit試劑盒從人血漿中提取循環(huán)游離DNA，提取的DNA于-80℃下保存。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測肝癌預(yù)后標(biāo)志物TP53 R249S的ddPCR檢測方法，其特征在于，步驟(2)中所述ddPCR反應(yīng)體系為：ddPCR Supermix for probes 10μL，終濃度為250nM的TP53野生型探針TaqMan MGB(WT)或者TP53 R249S突變型探針TaqMan MGB(MT)0.8μL，終濃度為900nM的引物TP53-F 1μL，終濃度為900nM的引物TP53-R 1μL，DNA含量為8-12ng的DNA模板和滅菌雙蒸水7.2μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測肝癌預(yù)后標(biāo)志物TP53 R249S的ddPCR檢測方法，其特征在于，步驟(2)中所述ddPCR反應(yīng)體系包括8個體系，分別為突變型探針待測樣品DNA模板體系、突變型探針陽性對照體系、突變型探針陰性對照體系、突變型探針無模板對照體系、野生型探針待測樣品DNA模板體系、野生型探針陽性對照體系、野生型探針陰性對照體系、野生型探針無模板對照體系。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測肝癌預(yù)后標(biāo)志物TP53 R249S的ddPCR檢測方法，其特征在于，所述微滴生成方法為：將ddPCR反應(yīng)體系加入微滴發(fā)生卡中的孔中，然后在下方孔中加入70μL微滴生成油，放入微滴發(fā)生器中進(jìn)行微滴制備，等待2min后取出微滴發(fā)生卡。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測肝癌預(yù)后標(biāo)志物TP53 R249S的ddPCR檢測方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)流程為：95℃變性10分鐘；95℃變性30秒，58℃退火1分鐘，循環(huán)40次；98℃延伸10分鐘；最后保持在4℃。

9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測肝癌預(yù)后標(biāo)志物TP53 R249S的ddPCR檢測方法，其特征在于，步驟(5)中所述判斷方法為：有熒光信號的微滴為陽性微滴，無熒光信號的微滴為陰性微滴。