[發(fā)明專利]青錢柳基因CpSE1-like編碼序列的克隆及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010631113.7
• 申請日: 2020-07-03
• 公開（公告）號: CN111909942B
• 公開（公告）日: 2022-08-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 洑香香;陳小玲;陳必芹;方升佐;尚旭嵐
• 申請（專利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/6895;C12Q1/6851
• 代理公司: 南京縱橫知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32224
• 代理人: 王玉

本發(fā)明公開了一種青錢柳基因CpSE編碼序列的克隆及其應(yīng)用，屬于植物分子生物學(xué)和基因克隆技術(shù)領(lǐng)域。首先獲得青錢柳基因CpSE的編碼序列，在獲得青錢柳基因CpSE完整編碼區(qū)序列之后，設(shè)計該基因熒光定量引物并驗證其引物特異性。通過對青錢柳葉片中總?cè)坪恳约盎虮磉_(dá)水平之間的相關(guān)性分析，結(jié)果表明總?cè)坪颗cCpSE的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P0.05）。本發(fā)明對16株初選青錢柳優(yōu)良單株（根據(jù)三萜含量分為高含量組H（5株）、中含量組M（6株）和低含量組L（5株））葉片中該基因表達(dá)進(jìn)行測定，結(jié)果顯示通過九月份葉片中CpSE相對表達(dá)量能明顯將青錢柳高三萜含量組區(qū)別于其他組別，其結(jié)果可運用于青錢柳高三萜含量優(yōu)株的選育和推廣應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種青錢柳基因CpSE1-like編碼序列的克隆及其應(yīng)用，屬于植物分子生物學(xué)和基因克隆技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

青錢柳是我國特有的集藥用、材用、觀賞、保健價值于一體的多功能樹種，因其具有多種藥理活性而受到大眾青睞。三萜化合物作為青錢柳中重要的具有生物活性的化學(xué)成分，其含量高低是評定青錢柳產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)。選育優(yōu)良資源獲得三萜類化類物是青錢柳葉用人工林定向培育的主要目標(biāo)，而三萜類化合物代謝途徑中關(guān)鍵基因的時空表達(dá)特性是影響其產(chǎn)物積累的重要因素。對三萜類化合物代謝途徑研究表明，SE基因是萜類合成途徑下游眾多分支中，通向三萜合成通路上且最靠近目標(biāo)產(chǎn)物的關(guān)鍵酶基因，該基因的表達(dá)對于植物總?cè)坪烤哂凶钪苯拥挠绊憽４饲埃坪繙y定的結(jié)果是僅有的篩選高三萜含量優(yōu)良單株的方法，該方法具有取材樣大，操作復(fù)雜且實驗周期長等不足。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種青錢柳基因CpSE1-like編碼序列的克隆，根據(jù)其編碼序列設(shè)計定量引物探針，監(jiān)測關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，只需幾片葉子作為檢測對象，實驗當(dāng)天即可獲得檢測結(jié)果，該方法可以更高效的實現(xiàn)青錢柳優(yōu)良單株的選育。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種青錢柳基因CpSE1-like，所述CpSE1-like的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明還提供青錢柳基因CpSE1-like編碼序列的克隆引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

本發(fā)明還提供青錢柳基因CpSE1-like編碼序列的克隆方法，包括：

提取青錢柳總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；

以cDNA為模板，利用上述的引物，通過PCR擴(kuò)增獲得該基因完整編碼區(qū)序列；

回收并純化上述擴(kuò)增產(chǎn)物中的目的片段，連接轉(zhuǎn)化后進(jìn)行測序，得到青錢柳基因CpSE1-like的編碼序列。

本發(fā)明還提供依據(jù)上述的青錢柳基因CpSE1-like編碼序列設(shè)計熒光定量引物，并應(yīng)用于篩選青錢柳高三萜含量優(yōu)良單株中。所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQID NO：5所示。

所述qRT-PCR反應(yīng)體系為：SYBR Green預(yù)混樣10μL，10μmol/L的上下游引物各0.8μL，cDNA 2μL，去離子水6.4μL，總體積20μL。

所述qRT-PCR反應(yīng)程序為：95℃，40s；變性95℃，15s；退火55℃，30s；延伸72℃，35s，其中變性、退火、延伸設(shè)置40個循環(huán)。

本發(fā)明還提供上述的青錢柳基因CpSE1-like探針引物應(yīng)用于青錢柳單株中CpSE1-like基因表達(dá)的季節(jié)動態(tài)變化中的應(yīng)用。

本發(fā)明所達(dá)到的有益效果：