[發明專利]具有立體選擇性的酮還原酶與(R)-3-羥基丁酸乙酯的不對稱合成方法

在審

• 申請號: 202010630439.8
• 申請日: 2020-06-30
• 公開（公告）號: CN111705068A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 黃勇開;張城孝;陳海濱;張迎新;紀搖搖;孫磊;劉曉威;彭紹瑧;吳臨政;徐青
• 申請（專利權）人: 寧波酶賽生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/04;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 浙江素豪律師事務所 33248
• 代理人: 楊璇

1.一種具有立體選擇性的酮還原酶，其特征在于，所述具有立體選擇性的酮還原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一種(R)-3-羥基丁酸乙酯的不對稱合成方法，其特征在于，包括：

作為反應底物的乙酰乙酸乙酯在具有立體選擇性的酮還原酶的催化下生成目標產物(R)-3-羥基丁酸乙酯，其中，所述具有立體選擇性的酮還原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根據權利要求2所述的(R)-3-羥基丁酸乙酯的不對稱合成方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：向反應容器中一并加入乙酰乙酸乙酯，異丙醇，包含所述具有立體選擇性的酮還原酶的重組大腸桿菌酶液，輔酶NAD；加熱，并攪拌反應；

S2：反應完全后，后處理，即得目標產物(R)-3-羥基丁酸乙酯。

4.根據權利要求3所述的(R)-3-羥基丁酸乙酯的不對稱合成方法，其特征在于，所述乙酰乙酸乙酯占反應體系總體積的體積濃度為40～46％，所述重組大腸桿菌酶液占反應體系總體積的體積濃度為8～15％，所述異丙醇占反應體系總體積的體積濃度為25～52％；并且，所述攪拌反應的溫度為25～45℃。

5.根據權利要求3所述的(R)-3-羥基丁酸乙酯的不對稱合成方法，其特征在于，所述重組大腸桿菌酶液的制備方法包括以下步驟：

P1：將表達所述具有立體選擇性的酮還原酶的重組大腸桿菌濕菌體與緩沖液混合；

P2：在800bar的壓力下進行均質破碎，得到酶液粗品；

P3：離心，取上清液，即得所述重組大腸桿菌酶液。

6.根據權利要求5所述的(R)-3-羥基丁酸乙酯的不對稱合成方法，其特征在于，所述緩沖液為PBS緩沖液。

7.根據權利要求6所述的(R)-3-羥基丁酸乙酯的不對稱合成方法，其特征在于，所述PBS緩沖液的濃度為0.1M，且所述PBS緩沖液的pH＝7.5。

8.根據權利要求5所述的(R)-3-羥基丁酸乙酯的不對稱合成方法，其特征在于，在步驟P1中，所述重組大腸桿菌濕菌體與所述緩沖液的混合比例為1g：6mL。

9.根據權利要求5所述的(R)-3-羥基丁酸乙酯的不對稱合成方法，其特征在于，所述重組大腸桿菌濕菌體的制備步驟包括：

P11：將所述具有立體選擇性的酮還原酶的核苷酸序列連接至表達載體質粒，電轉化至大腸桿菌感受態細胞，孵育1h，涂LB培養基，37℃培養箱過夜培養；接著，取1.5mL EP管，加入1mL TB培養基，挑單克隆于TB培養基，37℃，搖床培養；然后，加入15％甘油，混勻，-80℃保菌備用，即得重組大腸桿菌BL21菌株；

P12：將所述重組大腸桿菌BL21菌株接種至含氯霉素的LB培養基，置于30℃，搖床振蕩培養過夜；當培養液的OD 600達到2時，按5％(v/v)的接種量接入TB培養基，置于30℃，搖床振搖培養；當培養液的OD 600達到0.6-0.8時，加入終濃度為1mM的IPTG作為誘導劑，30℃誘導20h后，將培養液離心，棄上清液，收集細胞，即得所述重組大腸桿菌濕菌體。

10.根據權利要求9所述的(R)-3-羥基丁酸乙酯的不對稱合成方法，其特征在于，在步驟P11中，所述LB培養基中氯霉素的濃度為50μg/mL，且所述TB培養基中氯霉素的濃度為50μg/mL；在步驟P12中，所述LB培養基中氯霉素的濃度為30μg/mL。