[發(fā)明專利]一種利用流式細(xì)胞術(shù)快速檢測(cè)有活力的食用菌原生質(zhì)體數(shù)量的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010629892.7
• 申請(qǐng)日: 2020-07-03
• 公開（公告）號(hào): CN111999235A
• 公開（公告）日: 2020-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于浩;郭立忠;徐麗麗;胡春輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N15/14
• 分類號(hào): G01N15/14
• 代理公司: 青島合創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37264
• 代理人: 王曉曉

本發(fā)明提供了一種利用流式細(xì)胞術(shù)快速檢測(cè)有活力的食用菌原生質(zhì)體數(shù)量的方法，包括如下步驟：將食用菌原生質(zhì)體細(xì)胞過濾后，加入CFSE熒光染料染色作為樣本，或加入等量的二甲基亞砜染色作為陰性對(duì)照；然后利用含有488nm激光器的流式細(xì)胞儀對(duì)染色的原生質(zhì)體細(xì)胞進(jìn)行分析，在FSC/SSC散點(diǎn)圖上設(shè)置FSC閾值為50，調(diào)整FSC和SSC的電壓，在此圖圈出目的細(xì)胞群（P1門）；繪制散點(diǎn)圖FL1/SSC，用陰性對(duì)照管確定陰性細(xì)胞群位置，在FL1/SSC散點(diǎn)圖上FL1橫坐標(biāo)10²以外位置全部圈出設(shè)為P2門。P1門內(nèi)的是總原生質(zhì)體細(xì)胞，P2門內(nèi)的為有活力的原生質(zhì)體細(xì)胞。本發(fā)明的檢測(cè)方法能夠在段時(shí)間內(nèi)快速準(zhǔn)確獲得有活力的原生質(zhì)體數(shù)量，為食用菌原生質(zhì)體的制備和再生提供了快速有效的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食用菌育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用流式細(xì)胞儀快速檢測(cè)有活力的食用菌原生質(zhì)體數(shù)量的方法。

背景技術(shù)

目前我國缺乏適合工廠化栽培的食用菌品種，對(duì)食用菌生長(zhǎng)栽培的發(fā)育機(jī)制等也知之甚少，因此食用菌的遺傳育種和分子機(jī)制的研究就顯得尤為迫切。

由于食用菌是真菌，外層有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁包裹，對(duì)其進(jìn)行遺傳操作和分子改造都離不開原生質(zhì)體的制備。獲得有活力的原生質(zhì)體并對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)對(duì)于食用菌的遺傳育種和分子機(jī)制研究具有重要的參考價(jià)值。

傳統(tǒng)的原生質(zhì)體的計(jì)數(shù)方法為血球計(jì)數(shù)法，該方法存在較大誤差，且無法區(qū)分有活力的原生質(zhì)體和沒有活力的原生質(zhì)體。流式細(xì)胞術(shù)作為一種高效的計(jì)數(shù)手段，最先被應(yīng)用在微生物技術(shù)領(lǐng)域，隨后在細(xì)胞免疫學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)的是熒光信號(hào)，因此需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色才能對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。而目前常用的染料中PI染液只能對(duì)死細(xì)胞進(jìn)行染色，并不能對(duì)活細(xì)胞直接進(jìn)行檢測(cè)，且檢測(cè)結(jié)果可能存在較大的偏差；SYBR GreenI和SYT90染液雖能夠?qū)罴?xì)胞直接進(jìn)行染色，但染液對(duì)會(huì)影響原生質(zhì)體的活力，進(jìn)而影響原生質(zhì)體的再生率。

不同種類食用菌原生質(zhì)體細(xì)胞的大小差別較大，如羊肚菌的細(xì)胞較大，直徑在9.16～13.2μm，長(zhǎng)根菇的原生質(zhì)體細(xì)胞為5.90～7.18μm，真姬菇的原生質(zhì)體細(xì)胞則較小，直徑為2.10±5.02μm；而且在食用菌原生質(zhì)體制備過程發(fā)現(xiàn)，同一材料的原生質(zhì)體細(xì)胞的大小也存在差異。細(xì)胞大小的差異對(duì)于原生質(zhì)體的計(jì)數(shù)也會(huì)產(chǎn)生一定的影響。因此，非常需要一種能夠不受各種因素影響并快速檢測(cè)有活力的食用菌原生質(zhì)體細(xì)胞數(shù)量的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種利用流式細(xì)胞術(shù)快速檢測(cè)有活力的食用菌原生質(zhì)體數(shù)量的方法，該方法操作簡(jiǎn)單、效率高、檢測(cè)準(zhǔn)確，所使用CFSE染料不影響食用菌原生質(zhì)體細(xì)胞的活力和再生率。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一種利用流式細(xì)胞儀快速檢測(cè)有活力的食用菌原生質(zhì)體數(shù)量的方法，步驟如下：

(1)樣本制備與染色：食用菌酶解得到的食用菌原生質(zhì)體細(xì)胞經(jīng)篩網(wǎng)過濾后，加入CFSE熒光染液染色，得到染色的食用菌原生質(zhì)體細(xì)胞；

(2)流式細(xì)胞術(shù)的分析與測(cè)定：

a、使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析：將染色的食用菌原生質(zhì)體細(xì)胞放入流式細(xì)胞儀中，分別繪制FSC/SSC散點(diǎn)圖和FL1/SSC散點(diǎn)圖；設(shè)置FSC/SSC散點(diǎn)圖的 FSC閾值為50以去除食用菌原生質(zhì)體細(xì)胞碎片，調(diào)整FSC和SSC的電壓使染色的食用菌原生質(zhì)體細(xì)胞團(tuán)完全顯示并位于圖片中央位置，然后設(shè)P1門將上述細(xì)胞團(tuán)完全圈出，P1門內(nèi)顯示的細(xì)胞是總食用菌原生質(zhì)體細(xì)胞；在FL1/SSC散點(diǎn)圖上顯示P1門內(nèi)的食用菌原生質(zhì)體細(xì)胞，然后在FL1/SSC散點(diǎn)圖上將FL1信號(hào)大于10²的細(xì)胞圈門(P2門)，P2門內(nèi)顯示的的細(xì)胞是有活力的食用菌原生質(zhì)體細(xì)胞；

b、根據(jù)流式細(xì)胞儀的流速和收集時(shí)間計(jì)算食用菌原生質(zhì)體細(xì)胞濃度；