[發明專利]一種仿細胞外基質可打印復合生物墨水的制備方法

有效

• 申請號: 202010629252.6
• 申請日: 2020-07-03
• 公開（公告）號: CN111748526B
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發明（設計）人: 劉杰;李威霖;陳友
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 廣州市深研專利事務所(普通合伙) 44229
• 代理人: 姜若天

1.一種仿細胞外基質可打印復合生物墨水的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

(A)GelMA溶液的配制：將GelMA粉末和光引發劑溶于PBS中，在40-50℃攪拌至均勻，配成濃度最終濃度為5-15％的GelMA溶液；

(B)脫脂肪細胞外基質制備：將新鮮脂肪組織預處理后，20000-30000rpm搗碎處理5-10min，分別經0.25％胰蛋白酶-0.1％EDTA處理和3％Triton-X100處理1h后，經4％的脫氧膽酸鈉和100％異丙醇分別處理1h和6h，即得；

(C)脫脂肪細胞外基質溶液制備：將步驟(B)的脫脂肪細胞外基質制成細纖維狀，溶于0.01M HCL和1mg/mL的胃蛋白酶溶液中，4-10℃條件下攪拌48h后，低速離心10min，配制最終濃度為5-15mg/mL脫脂肪細胞外基質溶液；

(D)復合生物墨水配制：將步驟(A)制備的GelMA在適宜的溫度下預熱3-10min，在渦旋震蕩速度1500-2500rpm的條件下，將步驟(C)中的脫脂肪細胞外基質溶液緩慢加入，震蕩至溶液均勻混合，其中GelMA與脫細胞外基質的體積比為1-4:1，經過調節pH及過濾滅菌后，即可得仿細胞外基質可打印復合生物墨水；

步驟A所述的光引發劑為苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸鋰或巴斯夫Irgacure2959，濃度為1-2％；

步驟(B)所述的新鮮組織來源于豬皮下脂肪或者人體腹部脂肪，組織預處理方法為-80℃和37℃凍融循環5次；

步驟(D)所述的適宜溫度為40-50℃，調節pH為6.8-7.5。

2.根據權利要求1所述的一種仿細胞外基質可打印復合生物墨水的制備方法，其特征在于：步驟(C)所述的將脫脂肪細胞外基質制成細纖維狀的方法為搗碎機30000rpm處理3-5min。

3.根據權利要求1所述的一種仿細胞外基質可打印復合生物墨水的制備方法，其特征在于：步驟(C)所述的低速為3000-5000rpm。

4.根據權利要求1所述的一種仿細胞外基質可打印復合生物墨水的制備方法，其特征在于所述pH調節方法為：將復合生物墨水置于冰上，邊快速攪拌邊逐滴滴加1M的NaOH溶液。

5.權利要求1所述仿細胞外基質可打印復合生物墨水的使用方法，其特征在于包括如下步驟：

將制備的仿細胞外基質可打印復合生物墨水與腫瘤細胞懸液配制成載細胞的復合生物墨水，無菌注射器中吸取后，將其裝載在擠出式3D生物打印機，進行無菌打印；打印后的三維仿生載腫瘤細胞模型用405nm藍光照射固化交聯成型，無菌PBS清洗后放置于細胞培養基中，然后在37℃，5％CO₂培養箱中培養，經細胞生長、增殖、相關基因和蛋白表達后，最終形成類實體腫瘤微環境的體外腫瘤模型。