[發(fā)明專利]circ6148及其重組載體在促進(jìn)血管生成上的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010628229.5
• 申請(qǐng)日: 2020-07-01
• 公開（公告）號(hào): CN111733161B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈銘;肖軼婧;陸史俊;袁小琴;孫典;劉金明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/85;A61K31/7105;A61P35/00;A61P27/02;A61P25/16;A61P25/00;A61P9/10;A61P17/02;A61L27/54
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 殷星

本發(fā)明公開了circ6148及其重組載體在促進(jìn)血管生成上的應(yīng)用。本發(fā)明采用具有較低的免疫原性、較高的多向分化潛能且易于取材，一次取材獲取細(xì)胞量大的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)表明在hAMSC?CM刺激后HUVEC中circ6148表達(dá)增高，HUVEC遷移，成管能力均增加，細(xì)胞內(nèi)circ6148表達(dá)降低可以抑制hAMSC?CM導(dǎo)致的血管生成作用。在HUVEC中導(dǎo)入circ6148重組質(zhì)粒可模擬hAMSC?CM介導(dǎo)的HUVEC遷移，成管能力增加，促進(jìn)血管生成效果更優(yōu)。另外，通過重組質(zhì)粒技術(shù)獲得促進(jìn)血管生長的重組質(zhì)粒，獲得方法簡(jiǎn)單，且穩(wěn)定性好，彌補(bǔ)了hAMSC獲取困難，有效成分易分解等缺點(diǎn)，在促進(jìn)HUVEC成血管中有著重要作用，為拓展干細(xì)胞療法奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于血管生成研究領(lǐng)域，具體涉及circ6148及其重組載體在促進(jìn)血管生成上的應(yīng)用。

背景技術(shù)

血管生成在生長發(fā)育、器官和組織再生以及許多生理病理?xiàng)l件下都發(fā)揮著重要作用。致密的血管系統(tǒng)為高度合成代謝的組織細(xì)胞提供氧氣和營養(yǎng)并運(yùn)輸代謝廢物。血管新生過程中，需要氧氣和營養(yǎng)的組織會(huì)分泌促血管生成分子，觸發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞延伸出絲狀偽足，稱之為尖端細(xì)胞。這些尖端細(xì)胞引導(dǎo)萌芽，并將它們的絲狀足向血管生成信號(hào)的來源延伸，隨后細(xì)胞增殖以完成血管出芽。最終，尖端細(xì)胞與相鄰芽中的尖端細(xì)胞相連，建立新的導(dǎo)管環(huán)路。由此看來，由生長因子介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖在血管新生中十分重要。

干細(xì)胞由于其具有自我更新和多向分化潛能，近年來被用于細(xì)胞和組織再生。由于干細(xì)胞獲取困難，目前干細(xì)胞療法多采用異體細(xì)胞，由于其來源及排異反應(yīng)，安全性有待評(píng)估，且干細(xì)胞產(chǎn)量較低。

干細(xì)胞療法作為近十年來再生醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)，在促進(jìn)成血管方面也取得了很大進(jìn)展。干細(xì)胞是指機(jī)體具有自我更新和直接分化成其他細(xì)胞的雙重能力的細(xì)胞。天然的干細(xì)胞種類有:胚胎多能或全能干細(xì)胞和成人干細(xì)胞。成人干細(xì)胞主要包括骨髓(骨髓多能干細(xì)胞)、內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)、各種組織細(xì)胞(組織多能干細(xì)胞)和血液循環(huán)干細(xì)胞等。間充質(zhì)細(xì)胞(MSCs)具有多潛能、免疫應(yīng)答和旁分泌等特性，可分化為多種細(xì)胞系，具有促進(jìn)血管生成的潛能，有望成為再生醫(yī)學(xué)的候選細(xì)胞。羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSC)是娩后廢棄的胎盤中獲得的干細(xì)胞，其具有較低的免疫原性、較高的多向分化潛能及無倫理學(xué)限制等優(yōu)點(diǎn)，且易于取材，一次取材獲取細(xì)胞量大。近年來，使用間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(CM)代替細(xì)胞共培養(yǎng)研究間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)研究細(xì)胞的單項(xiàng)作用的排除細(xì)胞互作干擾。已有研究顯示間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基有促進(jìn)血管生成的作用。而條件培養(yǎng)基(CM)組分復(fù)雜，性質(zhì)不穩(wěn)定，易分解，故而我們希望找出在羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞成血管過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的生物分子，能大部分代替羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的促血管生成作用。

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一種共價(jià)閉合環(huán)狀單鏈RNA，無poly尾巴，由pre-mRNA通過反向剪切行成，性質(zhì)穩(wěn)定可以抵抗RNaseR降解，是近幾年研究興起的一種新型非編碼RNA。其具有獨(dú)特的通過共價(jià)鍵結(jié)合的環(huán)狀封閉結(jié)構(gòu)，無5’末端帽子結(jié)構(gòu)及3’末端poly(A)尾巴。隨著第二代測(cè)序的發(fā)展成熟以及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，越來越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)，并且有越來越多文章表明，如circHIPK3可作為RNA海綿吸附miR-558抑制膀胱癌血管新生有研究表明，circRNA可以通過多種機(jī)制促進(jìn)成血管，但大多數(shù)集中于腫瘤成血管研究。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供circ6148(hsa-circ0006148)及其重組載體在促進(jìn)血管生成上的應(yīng)用，本發(fā)明以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞前后的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基進(jìn)行外泌體芯片分析，根據(jù)表達(dá)值篩選合適的circRNA。并在血管內(nèi)皮細(xì)胞中驗(yàn)證，再利用由大腸桿菌內(nèi)獲取的circ6148重組質(zhì)粒代替hAMSC的促成血管作用，該應(yīng)用有效提高了血管生成的效率。另外，circ6148及其重組質(zhì)粒的獲取方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，彌補(bǔ)了hAMSC獲取困難、有效成分易分解等缺點(diǎn)，在促進(jìn)HUVEC成血管中有著重要作用。

為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：