[發明專利]通過抑制植物除草劑抗性基因表達去除色選漏檢轉基因種子的方法

在審

• 申請號: 202010626377.3
• 申請日: 2020-07-01
• 公開（公告）號: CN111850035A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 趙炳然;韶也;袁定陽;彭彥;余東;呂啟明;毛畢剛;柏連陽;袁隆平
• 申請（專利權）人: 湖南雜交水稻研究中心
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 長沙朕揚知識產權代理事務所(普通合伙) 43213
• 代理人: 楊斌;郭蓓霏

1.一種通過抑制植物除草劑抗性基因表達去除色選漏檢轉基因種子的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將抑制植物除草劑抗性基因表達的元件，與育性恢復基因、花粉致死基因和熒光標記基因構建含有四元轉基因元件的四元連鎖表達載體；

(2)將所述步驟(1)得到的四元連鎖表達載體轉化入對對應類型除草劑具有抗性的不育系中，獲得對對應類型除草劑敏感的繁殖系；

(3)使所述步驟(2)得到的繁殖系自交結實，其自交后代中包括含有所述四元轉基因元件的繁殖系和不含所述四元轉基因元件的不育系，經過色選機篩選，將發熒光的繁殖系種子與不發熒光的不育系種子分開；

(4)采用對應類型除草劑對所述步驟(3)色選機篩選后的不育系種子進行除雜，去除色選漏檢的含有所述四元轉基因元件的繁殖系種子。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物除草劑抗性基因為水稻OsHIS1基因，其對應類型除草劑為β三酮類除草劑，所述β-三酮類除草劑包括磺草酮、硝磺草酮、雙環磺草酮、環磺酮和呋喃磺草酮中的任意一種或幾種。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述抑制植物除草劑抗性基因表達的元件包括CRISPRi沉默元件或RNAi沉默元件。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述CRISPRi沉默元件由所述植物除草劑抗性基因的CIRSPRi靶點雙鏈通過酶切連接反應連入載體pHdzCas9-KRAB后得到，所述植物除草劑抗性基因的CIRSPRi靶點雙鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述RNAi沉默元件由植物除草劑抗性基因的CDS序列和其反向互補序列以及Linker序列通過酶切連接反應一起連入RNAi沉默載體pEGRNAi后得到，所述CDS序列和其反向互補序列之間由Linker序列隔開；所述CDS序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向互補序列如SEQ ID NO.4所示，所述Linker序列如SEQ ID NO.5所示。

6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，若所述不育系為雄性不育系，所述育性恢復基因包括EAT1、PTC1、TDR或CYP704B2；若所述不育系為雌性不育系，所述育性恢復基因為PTB1。

7.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，所述花粉致死基因元件包括如SEQ ID NO.7所示的Pg47啟動子序列、如SEQ ID NO.1所示的ZMAA1基因cDNA序列和如SEQID NO.8所示的IN2-1終止子序列。

8.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，所述熒光標記基因元件包括如SEQ ID NO.9所示的1tp啟動子序列、如SEQ ID NO.2所示的DsRed基因cDNA序列和如SEQ IDNO.10所示的PINII終止子序列。

9.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述四元連鎖表達載體通過農桿菌介導轉化入對對應類型除草劑具有抗性的不育系中。

10.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，采用對應類型除草劑對色選機篩選得到的不育系種子進行去除的方式具體包括：采用對應類型除草劑對所述不育系種子進行包衣、在所述不育系種子浸種催芽過程中添加對應類型除草劑或在所述不育系種子播種、種植后進行田間噴施對應類型除草劑。