[發明專利]栽培花生AhGPAT9B基因的克隆方法

在審

• 申請號: 202010625986.7
• 申請日: 2020-07-02
• 公開（公告）號: CN111748565A
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 劉風珍;萬勇善;張秀榮;呂玉英;駱璐;張昆;朱素青;楊會
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/10;C12N15/11
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 薛鵬喜

1.一種用于克隆栽培花生AhGPAT9B基因的引物組合，其特征在于，所述引物組合包括：

引物對BG01，其序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

引物對BG02，其序列分別如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

引物對BG03，其序列分別如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

引物對BG04，其序列分別如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

引物對BG05，其序列分別如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；

引物對BG06，其序列分別如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；和，

引物對BG07，其序列分別如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。

2.權利要求1所述的引物組合在從栽培花生中克隆獲得B染色體組AhGPAT9B基因中的應用。

3.一種栽培花生AhGPAT9B基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)以從花生葉片中提取的基因組DNA為模板，利用權利要求1所述的引物組合進行PCR擴增，得到7段PCR擴增產物；

(2)將步驟(1)得到的7段PCR擴增產物分別與克隆載體連接，篩選陽性克隆，將陽性克隆進行擴大培養，并進行測序；

(3)將測序正確的7個片段進行拼接，得到完整的包含5’和3’末端的AhGPAT9B全長DNA序列。

4.根據權利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步驟(1)中，PCR擴增的體系為20μL，包括：模板DNA 2μL，10μM的上/下游引物各0.5μL，10×PCR bufferⅡ2μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，TransStart Taq 0.2μL，ddH₂O 13.2μL。

5.根據權利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步驟(1)中，PCR擴增的條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，(50-59℃)退火45s，72℃延伸1.5min，35個循環；72℃后延伸10min。

6.根據權利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步驟(2)中，PCR擴增產物與克隆載體連接的方法為：將4μL PCR擴增產物和1μL克隆載體混合，25℃反應20min。

7.根據權利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步驟(3)中，所述拼接具體為：將測序正確DNA片段在DNAMAN軟件中依次進行比對分析，利用相鄰擴增片段間的重疊部分進行序列拼接，獲得完整AhGPAT9B基因全長序列。