[發明專利]由自養、異養反硝化菌群制備的復合固體顆粒及制備方法

在審

• 申請號: 202010624906.6
• 申請日: 2020-07-02
• 公開（公告）號: CN111925955A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 王煜;李一平;程月;施媛媛;王亞寧;潘泓哲;李金華
• 申請（專利權）人: 河海大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C02F11/02;C02F3/34;C12R1/01;C12R1/125;C12R1/38;C12R1/05
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 成立珍

1.一種由自養、異養反硝化菌群制備的復合固體顆粒，其特征在于，所述復合固體顆粒由自養反硝化細菌和異養反硝化細菌組成；所述的自養反硝化細菌為脫氮硫桿菌，異養反硝化細菌包括枯草芽孢桿菌、蒙氏假單胞菌和糞產堿桿菌；所述復合固體顆粒按重量百分比包括脫氮硫桿菌15％-20％，枯草芽孢桿菌30％-40％，蒙式假單胞菌15％-25％和糞產堿桿菌25％-30％。

2.一種由自養、異養反硝化菌群制備復合固體顆粒的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：用接種環取斜面保種的脫氮硫桿菌、枯草芽孢桿菌、蒙氏假單胞菌和糞產堿桿菌各兩環，分別接種于各自的固體培養基中進行培養，培養溫度均為30-35℃，培養時間均為1-5d，分別得到脫氮硫桿菌、枯草芽孢桿菌、蒙氏假單胞菌和糞產堿桿菌的活化菌種；

步驟2：根據各菌種對氧氣需求的不同，分別將各菌種的種子培養基分裝至250mL或500mL三角瓶中；用接種環取脫氮硫桿菌活化菌、枯草芽孢桿菌活化菌、蒙氏假單胞菌活化菌和糞產堿桿菌活化菌各兩環，接種于各自的種子培養基中進行搖床振蕩培養，分別得到脫氮硫桿菌、枯草芽孢桿菌、蒙氏假單胞菌和糞產堿桿菌的種子液；

步驟3：將脫氮硫桿菌、枯草芽孢桿菌、蒙氏假單胞菌和糞產堿桿菌的種子液分別接種于各自的發酵培養基進行搖床振蕩培養，然后分別得到脫氮硫桿菌、枯草芽孢桿菌、蒙氏假單胞菌和糞產堿桿菌的高活性菌液；

步驟4：將步驟3得到的高活性菌液按照重量百分比：脫氮硫桿菌15％-20％，枯草芽孢桿菌30％-40％，蒙式假單胞菌15％-25％，糞產堿桿菌25％-30％，進行混合，得復合菌液；

步驟5：取步驟4得到的復合菌液，進行5000r/min離心處理，去除上清液，得濕菌體；

步驟6：將步驟5得到的濕菌體在搖擺機上制粒，再進行干燥處理；

步驟7：將步驟6得到的物料在30℃條件下進行粉碎，再過50目篩網，篩后粗料重新粉碎，得到由自養—異養反硝化菌群制備的高活性復合固體顆粒。

3.根據權利要求2所述的由自養、異養反硝化菌群制備復合固體顆粒的方法，其特征在于，所述步驟1中固體培養基均為牛肉膏蛋白胨培養基，按重量百分比由100重量份的水，5重量份的牛肉膏，10重量份的蛋白胨，5重量份的氯化鈣和20重量份的瓊脂配置而成。

4.根據權利要求3所述的由自養、異養反硝化菌群制備復合固體顆粒的方法，其特征在于，所述步驟2中脫氮硫桿菌種子培養基按重量百分比由100重量份的水中添加1重量份的葡萄糖，1重量份的玉米漿，0.6重量份的蛋白胨，1重量份的酵母膏，0.15重量份的氯化鈣，0.5重量份的磷酸二氫鉀和0.05重量份的硫酸鎂配置而成；取200mL所述脫氮硫桿菌種子培養基至250mL三角瓶中，將脫氮硫桿菌的活化菌種接種于種子培養基中進行搖床振蕩培養，在光照強度5000x條件下，搖床振蕩培養轉速240r/min，搖床振蕩培養溫度33℃，搖床振蕩培養時間6d。

5.根據權利要求4所述的由自養、異養反硝化菌群制備復合固體顆粒的方法，其特征在于，枯草芽孢桿菌的種子培養基按重量百分比由100重量份的水，10重量份的胰蛋白胨，5重量份的氯化鈉和5重量份的酵母提取物配置而成；取100mL所述枯草芽孢桿菌種子培養基至500mL三角瓶中，將枯草芽孢桿菌的活化菌種接種于種子培養基中進行搖床振蕩培養，搖床振蕩培養轉速120r/min，搖床振蕩培養溫度37℃，搖床振蕩培養時間24h。

6.根據權利要求5所述的由自養、異養反硝化菌群制備復合固體顆粒的方法，其特征在于，蒙氏假單胞菌的種子培養基按重量百分比由100重量份的水，3重量份的葡萄糖，1重量份的蛋白胨，0.5重量份的牛肉膏，0.5重量份的硝酸銨，0.2重量份的磷酸二氫鉀和0.1重量份的硫酸鎂配置而成；取100mL所述蒙氏假單胞菌種子培養基至250mL三角瓶中，將蒙氏假單胞菌的活化菌種接種于種子培養基中進行搖床振蕩培養，搖床振蕩培養轉速180r/min，搖床振蕩培養溫度30℃，搖床振蕩培養時間24h。