[發明專利]一種檢測前列腺癌患者外周血循環腫瘤細胞PSA表達的免疫熒光試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202010624659.X
• 申請日: 2020-07-01
• 公開（公告）號: CN111638350A
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 侯景陽;李文濤;李琛琛;洪瑛
• 申請（專利權）人: 山東凱歌智能機器有限公司
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/574;G01N33/569;B01D29/05
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本發明公開了種檢測前列腺癌患者外周血循環腫瘤細胞PSA表達的免疫熒光試劑盒及檢測方法，試劑盒包括稀釋液，脫色液，染色液A，染色液B，甲醇、2%PFA，10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗PSA組成的一抗混懸液，熒光標記的羊抗小鼠、熒光標記的羊抗大鼠、熒光標記的羊抗兔組成的二抗混懸液，DAPI封片劑；檢測方法包括外周血采集，膜過濾分離，染色，判斷是否存在CTC，并通過免疫熒光方法檢測外周血CTC的PSA表達情況。本專利提供的方法，不用穿刺活檢獲取組織標本即可檢測到晚期或復發前列腺癌患者PSA表達情況，利用微創技術，能夠實現實時動態檢測。

技術領域

本發明提供了一種檢測前列腺癌患者外周血循環腫瘤細胞PSA表達的免疫熒光試劑盒及檢測方法，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

在世界范圍內，前列腺癌發病率居男性惡性腫瘤第2位，癌癥特異性死亡居第6位。2015中國腫瘤登記年報顯示，2011年中國前列腺癌發病率居惡性腫瘤第9位，城市男性前列腺癌的發病率和死亡率在男性惡性腫瘤中分別居第6位和第9位。前列腺癌治療的難點是轉移性前列腺癌，尤其是內分泌治療后出現的去勢抵抗現象，目前轉移性前列腺癌去勢抵抗后的治療手段有限，并且會出現所有的常規治療手段（放療、化療、內分泌治療、靶向治療）都失效的情況。

隨著分子生物學的發展，中晚期前列腺細胞癌的免疫治療逐漸興起，初步的臨床試驗也取得了較好的療效，目前多項III期臨床試驗正在開展。1979年首次報道血清前列腺特異性抗原(prostate．specific antigen，PSA)可作為前列腺癌的診斷工具，目前，PSA對前列腺癌的診斷作用、疾病惡性程度以及預后的判斷在歐美等發達國家已經有較深入的研究。PSA是主要由位于前列腺的腺泡和導管內前列腺上皮細胞產生的一種糖蛋白，主要集中在前列腺組織內，正常情況下PSA在血清的中的水平是非常低的。導致正常前列腺上皮結構破壞的任何疾病如前列腺疾病，炎癥或外傷等都可以引起前列腺組織內的PSA漏出，并大量進入血循環導致血清PSA升高。血清PSA水平已成為前列腺癌檢測的一個重要標志物。目前，國內外前列腺癌診治指南均認為：前列腺癌PSA突變檢測的時間點包括初診時及爭取在疾病進展時再次檢測，應通過重復檢測減少假陽性和假陰性。

循環腫瘤細胞（Circulating tumor cell，CTC）是從實體腫瘤脫落進入外周血液循環的腫瘤細胞，自1989年被發現以來，目前已有多種方法用于外周血循環腫瘤細胞的檢測。近期研究表明，其檢測對于評估腫瘤患者尤其是晚期腫瘤患者的預后以及選擇合適的個體化治療具有重要的臨床意義。因CTC檢測具有微創、實時檢測等特點，被稱為腫瘤的“液態活檢”。

免疫熒光分析技術即將免疫學方法(抗原抗體特異結合)與熒光標記技術結合起來用以研究特異蛋白抗原在細胞內分布的方法。由于熒光素所發出的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，熒光素受激發光的照射而發出明亮的熒光(黃綠色或橘紅色)，可以看見熒光所在的細胞或組織，利用定量技術測定含量，從而對抗原進行細胞定性和定位分析。

針對目前臨床實踐中，前列腺癌患者PSA檢測的標本主要為腫瘤組織，來源于手術或穿刺活檢，很難做到多次或實時檢測。因此，檢測循環腫瘤細胞(CTC)PSA表達情況對前列腺癌預后及免疫治療療效評估具有重要價值。