[發(fā)明專利]一種高純度胰激肽原酶的分離純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010623286.4
• 申請日: 2020-07-02
• 公開（公告）號: CN111733150B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發(fā)明（設計）人: 丁嘯嘯;曹植木;李銀海;顧會軍;潘勝;朱媛媛
• 申請（專利權）人: 浙江豐安生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種高純度胰激肽原酶的分離純化方法，其特征在于：包括以下步驟：

a.從豬胰中提取粗胰酶，向600-700份水中加入1-2份冰醋酸，再向醋酸溶液中加入20-30份粗胰酶和20-30份聚乙二醇，在10-20℃條件下靜置12-16h；

b.板框壓濾步驟a中靜置后的混合液，板框壓濾后獲得清液；

c.將步驟b中獲得的清液上樣至平衡處理后的陰離子交換層析柱，采用pH 5.1 0.5M的乙酸鈉進行洗脫；

d.向步驟c中獲得的洗脫液中加入等體積的反膠束溶液，漩渦混合1-5min，靜置分相；

e.取萃取分相后的有機相，加入等體積的反萃取水相，漩渦混合1-5min，靜置分相；

f.取步驟e中分相后的水相，加入0.01-0.1份穩(wěn)定劑，冷凍干燥制得高純度胰激肽原酶；

步驟d中，所述反膠束溶液的配置方法為取十六烷基三甲基溴化銨溶于有機溶劑中，配置成10-20mmol/L的溶液，所述有機溶劑為正己烷和正丁醇的混合液，正己烷和正丁醇的體積比為4-5:1；

步驟e中，所述反萃取水相為含有1.0-2.0mol/L KBr和10-25%異丙醇的混合液。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種高純度胰激肽原酶的分離純化方法，其特征在于：步驟a中，粗胰酶的制備方法包括以下步驟：

Ⅰ.在0-4℃條件下，將新鮮豬胰或冷凍豬胰臟進行攪碎并研磨成漿狀；

Ⅱ.向胰漿中加入激活劑和保護劑，攪拌均勻，置于0-4℃放置6-12h；

Ⅲ.加入胰臟重量1-2倍的預冷的25%乙醇，置于15-25℃攪拌1-3h，過濾；

Ⅳ.向步驟Ⅲ中獲得的濾餅中加入胰臟重量1-2倍的預冷的25%乙醇，置于15-25℃攪拌1-3h，過濾；

Ⅴ.合并步驟Ⅲ和Ⅳ中獲得的濾液，向合并后的濾液中加入殼聚糖，攪拌10-20min，0-4℃條件下3000-5000r/min離心3-8min，收集沉淀；

Ⅵ.向沉淀中加入胰臟重量1-2倍的預冷的丙酮，再次收集沉淀，得到粗胰酶。

3.根據(jù)權利要求2所述的一種高純度胰激肽原酶的分離純化方法，其特征在于：步驟Ⅱ中，所述激活劑為CaCl₂和豬的十二指腸中的一種或兩種；所述激活劑的加入量為胰漿質量的0.2%-0.5%。

4.根據(jù)權利要求2所述的一種高純度胰激肽原酶的分離純化方法，其特征在于：步驟Ⅱ中，所述保護劑為乳糖、蔗糖和馬鈴薯淀粉中的一種或幾種；所述保護劑的加入量為胰漿質量的0.2%-0.5%。

5.根據(jù)權利要求2所述的一種高純度胰激肽原酶的分離純化方法，其特征在于：步驟Ⅴ中殼聚糖的加入量為胰漿質量的0.1-0.3%。

6.根據(jù)權利要求1所述的一種高純度胰激肽原酶的分離純化方法，其特征在于：步驟c中，陰離子交換層析柱采用pH 5.1 0.02M的乙酸鈉進行平衡，陰離子介質為QAE-Sephadex陰離子介質。

7.根據(jù)權利要求1所述的一種高純度胰激肽原酶的分離純化方法，其特征在于：步驟f中，所述穩(wěn)定劑為海藻糖和透明質酸中的一種或兩種。