[發(fā)明專利]一種過表達(dá)角鯊烯合成酶基因的裂殖壺菌基因工程菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010623200.8
• 申請日: 2020-06-30
• 公開（公告）號: CN111893049A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 凌雪萍;楊慶華;張學(xué)良;周豪;盧英華;陳翠雪
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/80;C12P5/02;C12R1/645
• 代理公司: 廈門市首創(chuàng)君合專利事務(wù)所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;秦彥蘇

本發(fā)明公開了一種過表達(dá)角鯊烯合成酶基因的裂殖壺菌基因工程菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明采用裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)ATCC1381為原始菌株，通過基因工程手段在大腸桿菌中構(gòu)建過表達(dá)載體，選擇博萊霉素作為篩選抗性基因，真核生物的高保守序列18S rRNA作為同源臂，將線性化的過表達(dá)片段電轉(zhuǎn)進(jìn)入裂殖壺菌內(nèi)，得到一株高產(chǎn)角鯊烯的基因工程菌株，為微生物生產(chǎn)角鯊烯以及產(chǎn)品工業(yè)化奠定了理論基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及裂殖壺菌基因工程菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

角鯊烯是由6個異戊二烯單位構(gòu)成的脂質(zhì)不皂化物，因其具有防御病毒、延緩衰老、抗擊腫瘤等多種功效而被廣泛用于食品、醫(yī)療、美容等領(lǐng)域。角鯊烯目前市場的主要來源是鯊魚肝油，植物油中含量也較為豐富。隨著角鯊烯的市場需求逐日上升，自然資源限制和化學(xué)合成方法復(fù)雜的反應(yīng)以及極低的產(chǎn)率使角鯊烯滿足不了需求，所以利用微生物資源生產(chǎn)角鯊烯的方式已經(jīng)成為未來的發(fā)展趨勢。這種方式憑借著周期短、操作簡單、生產(chǎn)潛力大等優(yōu)勢引起了人們極大的關(guān)注。破囊壺菌、微藻、酵母以及類酵母是近年來研究的熱點(diǎn)。有報道顯示，從海水中篩選出來的破囊壺菌18W-13a角鯊烯產(chǎn)量可以達(dá)到1.29±0.13g/L；優(yōu)化后的釀酒酵母角鯊烯產(chǎn)量達(dá)到11.00g/L，是目前已知基因工程菌株的最高產(chǎn)量。

基因工程是改造菌株的重要方式，通過基因工程手段提高角鯊烯的產(chǎn)量是目前研究的重心。有報道顯示，通過基因改造將真菌甲羥戊酸途徑相關(guān)的基因?qū)氪竽c桿菌中表達(dá)，角鯊烯產(chǎn)量達(dá)到52.1mg/L，實現(xiàn)了大腸桿菌基因工程菌株產(chǎn)角鯊烯的重大突破；另外，在釀酒酵母中過表達(dá)酰基轉(zhuǎn)移酶的基因提高了油脂含量，為角鯊烯提供了更多的儲存空間。

裂殖壺菌屬于破囊壺菌屬，是一類海洋真菌，因其可以高產(chǎn)不飽和脂肪酸而廣為人知。裂殖壺菌生長速度快，發(fā)酵周期短，耐機(jī)械攪拌，是一種食品安全菌。角鯊烯是裂殖壺菌甲羥戊酸途徑中合成甾醇類化合物的中間產(chǎn)物，在法尼轉(zhuǎn)移酶或角鯊烯合酶催化下，兩個法尼焦磷酸頭頭縮合并被NADPH還原為含有30個碳的碳?xì)浠衔铩酋徬?。裂殖壺菌油脂含量占?xì)胞干重的50％以上，為角鯊烯提供了良好的儲存場所。截止目前還未有通過基因工程技術(shù)對裂殖壺菌進(jìn)行改造以生產(chǎn)角鯊烯的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供了一種過表達(dá)角鯊烯合成酶基因的裂殖壺菌基因工程菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明以Schizochytrium sp.ATCC1381為受體菌株，通過過表達(dá)鯊烯合成酶基因(SQS)以提高重組菌中角鯊烯的產(chǎn)量，這對未來裂殖壺菌的基礎(chǔ)理論研究和產(chǎn)品開發(fā)具有重要的意義。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是：

一種過表達(dá)角鯊烯合成酶基因的裂殖壺菌基因工程菌株，所述菌株是選用產(chǎn)油Schizochytrium sp.ATCC1381為材料構(gòu)建而成，所述菌株含有來源于Schizochytriumsp.ATCC1381的角鯊烯合成酶基因SQS。

所述菌株中的角鯊烯合成酶基因(SQS)克隆于原始Schizochytriumsp.ATCC1381，該菌株對所述的角鯊烯合成酶基因(SQS)過表達(dá)，增加了基因拷貝數(shù)，提高了角鯊烯產(chǎn)量。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是：

一種過表達(dá)角鯊烯合成酶基因的裂殖壺菌基因工程菌株的構(gòu)建方法，包括：

1)克隆來源于Schizochytrium sp.ATCC1381的角鯊烯合成酶基因SQS，并通過基因同源重組技術(shù)將該基因插入pBluzeo-18S質(zhì)粒中，構(gòu)建過表達(dá)載體pBluzeo-SQS-18S；

2)用線性化后的所述過表達(dá)載體pBluzeo-SQS-18S電轉(zhuǎn)導(dǎo)入Schizochytriumsp.ATCC1381，獲得過表達(dá)角鯊烯合成酶基因SQS的裂殖壺菌基因工程菌株。