[發明專利]一種核酸聚合酶活性檢測方法的應用及試劑盒

有效

• 申請號: 202010621690.8
• 申請日: 2020-06-30
• 公開（公告）號: CN111635932B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 黃秀;付亮劍
• 申請（專利權）人: 北京啟衡星生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/48
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 于晶晶

本發明公開了一種應用于抗體封閉核酸聚合酶活性評估和核酸聚合酶延伸活性評估的核酸聚合酶活性檢測方法及試劑盒，所述核酸聚合酶活性檢測方法為：檢測核酸聚合酶延伸活性的模板為單鏈DNA，所述單鏈DNA與對應單鏈DNA設計的引物結合后加入核酸聚合酶進行qPCR鏈式反應，基于反應結果分析核酸聚合酶的活性。該檢測方法及試劑盒解決了以PCR反應所產生的引物二聚體以及非特異性產物為檢測結果的復雜體系，其能夠直接以單鏈DNA作為模板，進行qPCR鏈式反應來評估抗體封閉核酸聚合酶的活性和評估核酸聚合酶的延伸活性。

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，特別是涉及一種核酸聚合酶活性檢測方法的應用及試劑盒。

背景技術

聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction，PCR)是常用的分子檢測技術，PCR技術是以雙鏈DNA作為模板，單鏈寡核苷酸為引物，通過熱穩定的DNA聚合酶在一定反應環境內催化引物按堿基互補配對原則沿著模板鏈延伸。經過熱變性、退火、延伸三個步驟的重復循環，實現在體外將特定的核苷酸片段進行指數級擴增的目的。

PCR發生循環反應時對不同的循環步驟有不同的溫度，要求的溫度分別為變性(90℃左右)、退火(50℃左右)、延伸(70℃左右)。Taq DNA聚合酶在90℃以上仍能保持一定活性，因而是PCR反應常用的聚合酶。

TaqDNA聚合酶的最高生物學活性溫度在70℃～75℃，然而PCR反應在升溫時(20℃～70℃)，TaqDNA聚合酶仍然有一定的聚合酶活性，如果沒有進行熱啟動封閉，那么聚合酶就可能在該環境下進行催化延伸，容易使PCR反應發生引物二聚體以及非特異性的擴增，影響產物的特異性。因此如何在初始循環的熱變性前將TaqDNA聚合酶及高保真聚合酶的延伸活性進行抑制成為了現今的研究熱點。研究發現可以通過對酶進行化學修飾、物理隔絕法、抗原抗體法、設計特殊的引物或者用基因工程的方法對酶進行結構改造來將TaqDNA聚合酶在未達到最適反應溫度前的酶延伸活性進行抑制，實現熱啟動的目的。

目前檢測聚合酶的延伸活性的抑制效果常用的手段是通過設計某些特定的容易出現非特異擴增的引物，以某些復雜的雙鏈DNA為模板，進行PCR反應(變性、復性、延伸)，最后通過產物電泳的方法，觀察電泳條帶的結果(非特異條帶、引物二聚體)是否存在或量的多少來判斷非特異擴增結果，進而推測在初始變性前(20℃～70℃)聚合酶的延伸活性是否被抑制。目前對聚合酶延伸活性的檢測沒有相關的針對性的試劑盒，在進行聚合酶延伸活性的檢測時，需要花費大量時間準備實驗材料，且實驗需要的實驗材料較多，操作繁雜，難以快速完成檢測。

針對上述問題，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的是提供一種應用于抗體封閉核酸聚合酶活性評估和核酸聚合酶延伸活性評估的核酸聚合酶活性檢測方法及試劑盒，該檢測方法及試劑盒解決了以PCR反應所產生的引物二聚體以及非特異性產物為檢測結果的復雜體系，其能夠直接以單鏈DNA作為模板，進行qPCR鏈式反應來評估抗體封閉核酸聚合酶的活性和評估核酸聚合酶的延伸活性。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種核酸聚合酶活性檢測方法的應用,核酸聚合酶活性檢測方法應用于抗體封閉核酸聚合酶活性的評估和核酸聚合酶延伸活性的評估，所述核酸聚合酶活性檢測方法為：

檢測核酸聚合酶延伸活性的模板為單鏈DNA，所述單鏈DNA與對應單鏈DNA設計的引物結合后加入核酸聚合酶進行qPCR鏈式反應，基于反應結果分析核酸聚合酶的活性。

優選的，核酸聚合酶活性檢測方法應用于抗體封閉Taq DNA聚合酶、高保真聚合酶活性的評估和Taq DNA聚合酶、高保真聚合酶延伸活性的評估。

一種實現上述應用的試劑盒，包含10×PCR buffer、dNTP、熒光染料以及上述的單鏈DNA和對應單鏈DNA設計的引物。