[發(fā)明專利]一種利用酶催化制備2’-脫氧腺苷純品的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010621604.3
• 申請(qǐng)日: 2020-07-01
• 公開（公告）號(hào): CN111500659B
• 公開（公告）日: 2020-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 原海亮;陶曉陽;秦建新;馮永良
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州匯涵醫(yī)用科技發(fā)展有限公司
• 主分類號(hào): C12P19/40
• 分類號(hào): C12P19/40;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 常熟市常新專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32113
• 代理人: 朱偉軍

一種利用酶催化制備2’?脫氧腺苷純品的方法，將N?脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶重組大腸桿菌菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)發(fā)酵，得到N?脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶粗品；將脫氧核糖供體和堿基供體按比例稱量后加入反應(yīng)體系，加入N?脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶粗品攪拌反應(yīng)，得到2’?脫氧腺苷酶催化反應(yīng)液；對(duì)2’?脫氧腺苷酶催化反應(yīng)液加熱，再離心除去不溶物，取上清液即得到含2’?脫氧腺苷產(chǎn)品粗液；用堿性溶液對(duì)含2’?脫氧腺苷產(chǎn)品粗液的pH值調(diào)整，放置于低溫環(huán)境進(jìn)行結(jié)晶，干燥處理，得到2’?脫氧腺苷粗品；將預(yù)冷的堿水加入到2’?脫氧腺苷粗品中，再在低溫下攪拌洗雜，除去液體，得到固體物并干燥處理。節(jié)省原料，提高制備效率，降低制備成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于重組酶催化工程和分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用酶催化制備2’-脫氧腺苷純品的方法。

背景技術(shù)

2’-脫氧腺苷（2’-Deoxyadenosine，縮寫dA），也稱“2’-脫氧核糖腺嘌呤核苷”，是一種天然的脫氧核糖核苷，作為遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸（DNA）的有機(jī)組成成分，參與生物機(jī)體細(xì)胞的遺傳信息的傳遞。2’-脫氧腺苷可作為基因藥物和基因工程的原材料，并且還是許多抗病毒、抗腫瘤藥物的重要中間體，比如用于抗逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的藥物地丹諾辛（2，3-雙脫氧肌苷），以及用于慢性淋巴細(xì)胞白血病的治療的氟達(dá)拉濱（阿糖腺苷的氟化核苷類似物）和治療淋巴細(xì)胞增殖類疾病用的克拉屈濱（2-氯-2’-脫氧腺苷），在抗皰疹病毒藥物中大多數(shù)也是核苷、脫氧核苷類似物。隨著健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，特別是經(jīng)過2019年新冠狀肺炎病毒的傳播，對(duì)抗病毒藥物的需求更加迫切，核苷類似物作為抗病毒藥物的重要組成部分，需求量也在急劇增加。

2’-脫氧腺苷作為核苷類似物的中間體，其合成途徑主要有化學(xué)合成法、生物發(fā)酵法以及酶工程合成法，化學(xué)合成法如專利CN 105884846 B（一種2’-脫氧腺苷的合成方法）所述，將腺苷采用二烷基氧化物作為酯化劑進(jìn)行酯化，酰化劑和縛酸劑的酰化作用，得到酰化物，酰化物再經(jīng)過還原和純化處理，得到產(chǎn)物2’-脫氧腺苷，純度在99%左右，但是整個(gè)化學(xué)合成依賴苛刻的反應(yīng)條件，并且對(duì)環(huán)境容易造成污染；專利CN104178541B（一種利用大腸埃希氏菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)2’-脫氧腺苷的方法）中使用核苷酸磷酸化酶來實(shí)現(xiàn)2’-脫氧腺苷的合成，但是其反應(yīng)液需要緩沖鹽，底物濃度只有3-5mmol，且需要3步結(jié)晶工藝，對(duì)于工業(yè)化放大生產(chǎn)有所限制。專利CN105754899B（一種N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶、編碼基因及其高產(chǎn)菌株和應(yīng)用） 提供希氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）來源的N-脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶以2’-脫氧尿苷為核糖供體來合成2’-脫氧腺苷，但底物濃度僅為10mmol/L，產(chǎn)率僅為40-60%（見說明書第0057段），同樣不足以滿足工業(yè)化放大生產(chǎn)的期望要求。

基于上述已有技術(shù)，有必要加以合理探索與改進(jìn)，下面將要介紹的技術(shù)方案便是在這種背景下產(chǎn)生的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的任務(wù)在于提供一種利用酶催化制備2’-脫氧腺苷純品的方法，該方法有助于避免對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染、有利于顯著提高底物濃度并簡(jiǎn)化純化工藝流程以及避免依賴繁瑣的層析柱工藝、有益于節(jié)省原料及提高制備效率而得以滿足產(chǎn)品的工業(yè)化放大生產(chǎn)要求。

本發(fā)明的任務(wù)是這樣來完成的，一種利用酶催化制備2’-脫氧腺苷純品的方法，包括以下步驟：

A) 制備N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶粗品，先將N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶重組大腸桿菌菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)發(fā)酵，得到N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶粗品；

B) 制備2’-脫氧腺苷酶催化反應(yīng)液，將脫氧核糖供體和堿基供體按比例稱量后加入反應(yīng)體系，加入純化水?dāng)嚢杌靹颍{(diào)整反應(yīng)液溫度，加入由步驟A）得到的N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶粗品攪拌反應(yīng)并且控制攪拌反應(yīng)的時(shí)間，得到2’-脫氧腺苷酶催化反應(yīng)液；

C) 制備含2’-脫氧腺苷產(chǎn)品粗液，先對(duì)由步驟B）得到的2’-脫氧腺苷酶催化反應(yīng)液加熱，再離心除去不溶物，取上清液即得到含2’-脫氧腺苷產(chǎn)品粗液；